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怎样做好DNA琼脂糖凝胶电泳回收

已有 6723 次阅读 2016-8-25 11:27 |系统分类:科研笔记|关键词:琼脂糖凝胶,回收| 回收, 琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶电泳回收DNA绝对是个痛苦的过程,先要配胶(我忽然想到一个笑话,师妹说:“师兄,晚上帮我配个种吧。”别问我怎么想到的,因为还有个笑话:“师妹,你胶配完了吗?”),胶配完了等着凉下来,电泳,切胶……,等半天,不仅回收率低,接触各种有毒有害物品(溴化乙锭,乙醇,紫外),而且变性或者受损的DNA有可能降低克隆效率。正所谓宁可重做PCR,坚决不做胶回收,这是谁说的?我说的。

本文总结了一些技巧,帮助提高DNA的回收率和纯度。

1. 尽可能切下最少的胶

大多数人都只是切下一片方形的凝胶块,没有翻过来把胶块正面和背面的多余凝胶去掉。如果倒的胶很厚,多余部分就不容忽视了,包裹DNA的凝胶去掉的越多,产量也就越高。我一般会顺便切成6-8个小块,直接装到EP管里,坚决不用师姐教的用枪头戳的办法,简直就是打地鼠。

2.尽量减少暴露在紫外光下的时间

UV光引起的DNA损伤会影响DNA的克隆性能。应该快速完成切胶,如果一次要切好几个,暂时不切的胶不要放在紫外下,切完一个放一个。

3.除去残留的苯酚

如果不用试剂盒,使用苯酚从琼脂糖中纯化DNA,残留的苯酚无法通过乙醇沉淀去除,会抑制连接反应。上清液在65℃下加热蒸发5分钟可以从水相中除去苯酚,沉淀DNA之前要冷却10-20分钟至室温,子曰:吸附要凉,洗脱要热。

4.更换一瓶新的琼脂糖

你信吗,琼脂糖有时候也会抑制酶活,可能是琼脂糖太旧、质量不好或者某些品牌就是不好使。如果遇到诡异的情况,不妨打开一瓶新的琼脂糖。

5.做对照

如果要判断某个问题是不是凝胶回收造成的,单酶切一个空载体,跑胶回收,应该很容易连接,克隆非常多才对,如果这样还无法克隆该DNA,则可能是其它因素,例如DNA的二级结构,在大肠杆菌中产生不稳定重复序列,或者编码了有毒的蛋白。

6.复性DNA

融胶的时候盐浓度很大,伴随加热导致DNA变性。如果回收洗脱的DNA大小只有预期的一半(因为它是单链的),应该把DNA在95℃加热一分钟,并缓慢冷却至室温完成复性。

7.再洗一遍

试剂盒中的洗涤缓冲液中含有乙醇,额外的清洗步骤有助于去掉膜上的融胶液残留,否则会抑制酶的活性。

8.确保所有的乙醇已经挥发

乙醇洗涤后的二氧化硅膜必须干燥,才能保证良好的回收率和克隆的成功率。要确定DNA中最后是否含有乙醇,简单的跑一下胶,如果样品往上涌,说明有乙醇残留。为了干燥得更彻底,把盖子完全打开,我有时候直接放到烘箱里烘一会。

9.别舍不得用好乙醇

不纯的酒精,例如工业酒精,含异丙醇,甲醇甚至苯,和这些东西从二氧化硅膜上蒸发不掉,如果回收的DNA有怪味,或者在-20°C不会结冻,又或者表面有油,赶紧换个纯一些的乙醇。

10. 加热洗脱缓冲液洗脱

加热洗脱缓冲液,能从膜上洗脱更多的DNA,从而提高产量。洗脱之前把洗脱缓冲液加热至70℃。或者离心前把吸附柱放在热水中加热5分钟也可。

好了,希望大家能够体会优雅的切胶回收是怎样一种体验了。


为什么能用苯酚抽提DNA?

普通PCR真的普通吗?

基因表达,未卜先知

外显子在哪里?

看见,启动子




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1 吴炬

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