panker的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/panker

博文

韩春雨老师的文章做了啥? 精选

已有 18354 次阅读 2016-5-9 22:59 |系统分类:论文交流

最近,朋友圈被韩春雨老师刷屏了,各种致敬,欢呼和反思……可是这篇文章主要研究了什么内容呢?不知道?韩老师该伤心了。本人也很关心该领域进展,看过几十篇CRISPR/Cas9的文章,使用该技术自己动手拿到了敲除小鼠,现在就简单介绍一下韩老师这篇文章。


原文链接在这里,欢迎有兴趣的同学自己阅读,(Nat Biotechnol现在影响因子40左右)文章不长,一共7页,包括4个主要结果, 5个Figure.

Nat Biotechnol. 2016 May 2. doi: 10.1038

DNA-guided genome editing using the Natrono bacterium gregoryi Argonaute.

Gao F, Shen XZ, Jiang F, Wu Y, Han C.


1N. gregoryi来源的Ago蛋白能够在DNA的指导下断裂DNA



已有报道5'磷酸化的单链DNA能够指导TtAgo和PfAgo断裂DNA,但是所需温度高于65度。作者用PSI-BLAST办法在NCBI上搜索到TtAgo和PfAgo的同源蛋白AFZ73749.1(NgAgo),纯化后能够在37度把环状DNA线性化。体系需要NgAgo,13–25 nt的正向和反向5'磷酸化的单链DNA。(图一)


2NgAgo可结合单链向导DNA,并使双链目标DNA断裂



转染293T细胞系后并未发现与NgAgo结合的DNA,说明人类细胞中5'磷酸化的单链DNA低到难以检测的水平。转染NgAgo表达载体和不同的向导DNA后发现NgAgo只能结合5'-磷酸化的单链DNA,但不能结合5'-磷酸化单链RNA,而且NgAgo与单链DNA的组装只发生在NgAgo产生后很短的时间内,一旦组装完成,其中的DNA在37 °C就不能被替换了。这种只能使用“原版”向导DNA的特性保证了NgAgo忠实地切割设计好的靶点(图二)

那么下一个问题,NgAgo在什么位置断裂DNA呢?实验结果显示NgAgo可以在ssDNA指导/目标区域1−20 nt内随机删除几个核苷酸,但作用方式和外切酶不一样。细胞转染实验证明NgAgo与Cas9-sgRNA体系效率相同,ssDNA长度为24 nt时效率最高(图三)


3NgAgo作用的目标范围广泛而错配耐受性低



NgAgo还有什么样的特点呢?作者又做了三种实验:在NgAgo蛋白上添加入核信号NLS后转染细胞,使用5个不同的ssDNA断裂目标基因DYRK1A,结果显示都可以断裂;使用42个不同的ssDNA断裂其它8个目标基因,结果一致;在多种细胞中重复了实验,也都可以断裂目标基因。(图四)

为了研究核苷酸错配对NgAgo活性的影响,作者突变了gDNA的每个碱基,单个碱基错配会导致活性下降73–100%,第8到11位突变活性下降85~100%,而任意位置的连续三个碱基突变会导致失活。这一点上NgAgo-gDNA体系要优于Cas9-sgRNA体系。


4NgAgo可以指导DNA片段精确地插入基因组中



在用同源DNA供体共转染293T细胞系后,DNA片段通过HDR修复精确地插入基因组中,同源重组后的细胞会表达GFP,流式细胞检测结果显示阳性细胞比例高达11.7%,且没有像Cas9一样造成脱靶(图5)。


好了,以上就是原文主要内容,文章还有大量附加材料。匆忙翻译,错误之处还望大家指正!欢迎转载,请保留二维码哦。


更多精彩,敬请期待……



长按二维码关注




韩春雨事件
https://blog.sciencenet.cn/blog-53939-976128.html

上一篇:科学网的小变化
下一篇:生物学实验室常用溶液配制
收藏 IP: 114.251.216.*| 热度|

25 杨正瓴 蔡小宁 牛登科 陆绮 范运年 郑斌 李颖业 李春杰 黄永义 黄彬彬 薛宇 强涛 许培扬 江克柱 赵保明 李天成 秦逸人 刘光银 杨峰峰 fumingxu rlxahz xiyouxiyou liuhaoa1234 huangshan biofans

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (21 个评论)

数据加载中...
扫一扫,分享此博文

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )

GMT+8, 2024-3-29 05:02

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部