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心脏基因治疗研究最新进展

已有 5596 次阅读 2017-6-26 08:37 |个人分类:科学书摘|系统分类:观点评述

心力衰竭是世界性的公共健康重大问题.随着人口的老龄化,其死亡率和住院率长期以来居高不下.据估计目前全球患病人数超过３８００万;在我国,心血管病患者约２.９亿,其中心力衰竭患者４５０万.长期以来,临床药物(β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、醛固酮抑制剂、利尿剂、窦房结离子通道抑制剂)和置入性器械治疗(心脏再同步化治疗、左心室辅助装置)为防治心力衰竭做出了巨大贡献,并且提高了患者的长期生存率.然而随着疾病的进展,心力衰竭患者仍然会进入疾病的终末期.因此新的心力衰竭治疗手段显得尤为重要.

近年来,随着分子生物学研究的快速进展,对心力衰竭相关信号通路分子的逐步深入认识,一些针对于心力衰竭治疗的新的分子靶点被鉴定出来;然而这些信号通路分子很难通过药理的方法来调控,因此运用基因的手段另辟蹊径,可以直接且特异地在分子和细胞水平上调控心力衰竭的病理过程.一些靶基因的研究已经从基础研究进入了临床试验阶段,并且已经取得了一定的治疗效果,展示出了革命性和突破性的治疗前景,但同时也存在着喜忧参半的现状.

心力衰竭的基因治疗定义

心力衰竭的基因治疗是通过化学、物理或生物等各种技术,将目的基因用载体包装后通过各种方法导入受体的心肌细胞或心肌组织中,通过过表达纠正或干扰表达在心力衰竭病理过程中异常表达的靶基因,从而起到治疗或减轻心力衰竭症状的治疗方法.

靶基因的选择

在心力衰竭中受影响的基因可分为三类.第一类为编码已确认的可影响心力衰竭进程蛋白质的基因,比如,编码钙处理蛋白、β肾上腺素能受体系统、肾素Ｇ血管紧张素系统的基因,此类基因因为与心力衰竭的作用明确,最有可能作为进行基因治疗的候选基因;第二类基因的表达与心力衰竭有关,但没有明确证据表明其起到影响心力衰竭的作用,如编码氨基末端脑钠肽原(NT-proBNP)的NPPB,其可作为心力衰竭的生物标记物,而不作为基因治疗的候选基因;第三类基因为通过基因芯片发现的数以千计的在心力衰竭中出现变化的基因,此类基因由于其与心力衰竭的关系有待阐明,尚不适合作为用于基因治疗的候选基因.心力衰竭的病理过程中,兴奋收缩偶联的异常存在于在心力衰竭发展过程中的各个节段.因此,针对于此的各种不同的离子通道蛋白、转运蛋白和关键蛋白的靶基因治疗均可能使心脏的收缩功能恢复.其他的靶基因包括增加血管新生、增加干细胞的归巢及具有细胞保护作用的靶基因.下面介绍几种常用的治疗心力衰竭的靶基因.

(一)增加心肌收缩力的靶基因

β肾上腺能系统的靶基因:β肾上腺素能系统是心肌收缩的关键调节系统之一.儿茶酚胺与β肾上腺素能受体(β-AR)结合,激活G蛋白和腺苷酸环化酶(AC),从而增高心肌细胞内环磷腺苷(cAMP)的浓度,继而活化蛋白激酶A(PKA)、增加心率和增强心肌收缩性,诱导心肌蛋白合成,从而导致心肌肥大.心力衰竭时β-AR明显下调,并且敏感性降低,这是因为交感神经长期兴奋抑制了β-AR的合成,受体与AC脱偶联和下游cAMP介导的传导途径修饰(如Gi增高导致Gs/Gi比值下降).G 蛋白偶联受体激酶-２(GRK２)是β-AR 的脱敏剂,因此通过增加β-AR 或βARKct(GRK_２的抑制剂)或AC的表达,均可以显著增加转基因动物心肌收缩性和左心室功能.

Jones等发现心脏手术时将编码人β_２-AR基因的腺病毒转染至猪心肌细胞,有助于改善左心室收缩功能.但持续刺激β-AR系统会引起心肌毒性和心律失常,加速心力衰竭.已有实验显示,过表达β_２-AR的转基因小鼠行主动脉缩窄术后,左心室心功能不全程度高于野生型小鼠.进一步研究发现过表达βARKct较过表达βＧAR能更有效地改善运动耐量、心功能、心室重构及心力衰竭相关性全身炎性反应等,提示减少对β-AR的脱敏比单纯增加β-AR的数量更有效.在心肌梗死后的实验猪心力衰竭模型中发现,AAV６.βARKct基因治疗可逆转心功能不全和心肌重塑,这些基础研究提示抑制GRK_２是治疗心力衰竭一个较有前景的靶点.此外,直接升高腺苷酸环化酶或可避免持续刺激β-AR而引发的不良反应,AC６基因在这一方面有独特的优势,Lai等经冠状动脉将编码AC６的腺病毒转入猪的心力衰竭模型,发现其可改善左心室功能、延缓左心室重构,同时cAMP的表达明显增改,而β-AR和G蛋白的数量没有增加.

(二)Ca^２＋调控蛋白靶基因

无论何种病因引起的心力衰竭,其共同病理特征均有钙稳态失调和心肌收缩舒张功能障碍.正常情况下,细胞内钙稳态通过细胞膜和肌浆网两个钙离子循环来维持,胞膜存在三种钙转运系统:电压依赖式钙通道(L型为主)、钠Ｇ钙交换体(NCX)及钙泵(PMCA);肌浆网通过肌浆网钙释放通道(主要为兰尼碱受体RyR２)、肌浆网钙泵(SERCA２a)及肌浆网腔内钙结合蛋白进行钙转运.上述钙离子蛋白在心脏的收缩功能中起到了核心作用,一旦这些钙离子蛋白有所异常,就很可能导致心肌浆网功能失调,进而导致心力衰竭.因此,目前一些心力衰竭基因治疗主要针对钙离子调控蛋白进行了大量的基础和临床实验.

１.肌浆网钙泵靶基因(SERCA２a) 心肌细胞收缩时,肌浆网钙释放通道开放,使Ca^２＋由肌浆内质网进入胞质中,而舒张时由SERCA将Ca^２＋重新摄取.心力衰竭时SERCA２a的mRNA 和蛋白水平均明显下降,活性减低,导致肌浆网摄取Ca^２＋的速度减低,影响心肌收缩功能.目前大多数针对钙稳态的基因治疗均以增加SERCA 或降低受磷蛋白(PLB)对SERCA２a的抑制作用为目标.将SERCA２a基因以腺病毒或腺相关病毒载体转入心肌梗死或压力超负荷所致心力衰竭大鼠、羊、猪心脏和临床心力衰竭患者分离出来的心肌细胞,均可改善心肌的收缩功能,并且室性心律失常减轻.在二尖瓣反流引起的心力衰竭实验猪中,经AAV１转入SERCA２a通过增加内皮细胞的一氧化氮合酶表达而改善冠状脉血流.在野百合碱引起的肺动脉高压所致的右心功能不全小鼠中,AAV１/SERCA２a减轻肺动脉重构和延缓右室重构进程.

２.小分子泛素样修饰体-１(SUMO-１)　SUMO-１是类泛素蛋白家族的重要成员之一,通过名为SUMO 化的转录后修饰与SERCA２a发生相互作用,以增强SERCA２a的稳定性和活性.SUMO-１被证实在实验动物和临床患者的衰竭心脏中均明显降低,在小鼠中敲除SUMO-１则直接出现心力衰竭.在衰竭心脏中SERCA２a的的SUMO 化也随之降低.有研究使用经AAV９病毒载体转入SUMO-１,可以逆转主动脉缩窄小鼠的心肌肥厚和心功能不全.在心肌梗死的实验猪上也发现AAV１/SUMO-１改善心肌梗死心脏的心功能,逆转左心室重构.

３.受磷蛋白(PLN)　

PLN是一种小膜蛋白,为５个单体结合成的一个五聚体,未磷酸化的PLB抑制SERCA２a与Ca^２＋的亲和力,降低SERCA２a的活性.PKA和CaMK可催化PLN磷酸化,后者与SERCA２a解离,消除对SERCA２a的抑制作用,使钙泵与Ca^２＋的亲和力增高, Ca^２＋转运速度加快.通过AAV 转入PLN 突变体能消除心肌梗死大鼠的左心室重构.在羊的动物实验中也得到发现,通过转入PLN 抑制性肽,SERCA２a活性增强,左心室收缩和舒张功能均明显改善.将携带重组S１６EPLN(一种受磷蛋白抑制剂)基因的腺相关病毒转移入心肌梗死后心力衰竭大鼠模型体内,可以改善心功能,延缓心室重构.在分离的人心肌细胞中也发现,使用腺病毒载体转入反义PLN 基因,明显改善心肌细胞的收缩和舒张速率.

４.蛋白磷酸酶１(PP１)和蛋白磷酸酶１抑制因子-１(I-１)　PP１去磷酸化PLN,增加PLN 对SERCA２a的抑制作用.I-１抑制PP１,因此PP１间接抑制SERCA２a,I-１则增强SERCA２a活性.心力衰竭患者心脏PP１活性增加,I-１表达降低.在主动脉缩窄小鼠,心脏持续性活化的(constitutively active)I-１过表达通过间接增加PLN 的磷酸化改善心功能.近年来,在心肌梗死的实验猪上进行的几个独立研究发现,AAV２,AAV８、AAV９作为载体表达I-１后,心功能明显改善.

５.钙传感蛋白S１００A１　钙传感蛋白S１００A１通过对RyR２和SERCA２A 的调控,介导钙离子的释放、摄取和转运,是心肌维持收缩和舒张功能最重要的调节因子之一.心力衰竭时心肌中钙传感蛋白S１００A１表达下降.经腺病毒将S１００A１基因转移心梗后心力衰竭大鼠及体外培养的心肌梗死后心力衰竭的大鼠心肌细胞,发现其可增加肌浆网对Ca^２＋的摄取,减少Ca^２＋向外转运,恢复肌浆网内Ca^２＋的负荷.此外,经冠状动脉内灌注携带重组S１００A１基因的腺病毒则可改变Ca^２＋调节,恢复心脏收缩功能.在心肌梗死的实验猪模型和分离的临床心力衰竭患者的心肌细胞上均发现经腺病毒或腺相关病毒转入S１００A１可通过增加RYR２和SERCA２a活性改善心功能.

(三)肌丝蛋白的靶基因

心肌细胞的收缩是肌动蛋白和肌凝蛋白相互作用的结果,其沿着肌丝蛋白移动的能量来源于ATP的水解.在动物实验中的研究发现,用２-deoxyATP代替ATP,能够明显通过增加肌凝蛋白与肌动蛋白的结合和循环运动能量,但是２-deoxyATP得生成有限,过表达R１R２酶能够显著增加２-deoxyATP的含量,从而导致心肌细胞收缩能力的增加,这已经在离体的心肌细胞中得到证实,同时在R１R２过表达的转基因小鼠中,左心室的收缩功能也明显增强.

(四)促进血管新生的靶基因

在缺血性心脏病中进行的大量基础和临床研究均证实血管内皮生长因子(VEGF)能够促进血管新生,然而临床试验的疗效却缺乏一致性,难以满意重复出基础研究中令人鼓舞的结果.其原因可能是过表达VEGF-A 后不能形成有效的血管腔(无血流).在小鼠的心梗模型中,用修饰后的RNA(modRNA)来瞬时高表达VEGF-A可以增加有效血管腔的生成,同时降低心肌梗死小鼠的死亡率.

(五)具有心肌保护作用的靶基因

心力衰竭是心功能渐进性恶化的病理生理过程,其与多种病理应激反应相关,如氧化应激、凋亡及缺血/再灌注损伤有关.近期研究发现血红素氧化酶-１的过表达对于缺血再灌注损伤具有保护作用,并且已经在动物实验中证实.

(六)促进干细胞归巢的靶基因

SDF-１/CXCR目前已经被证实能够促进干细胞向心肌梗死后心肌细胞归巢.SDF-１是一种趋化蛋白因子,能够与G蛋白偶联受体CXCR４相结合.SDF-１最开始被认为能够招募骨髓来源的干细胞归巢到受损的心肌组织,因此被认为是内源性组织修复的重要调节因子.临床前期实验已经证实了SDF-１在心肌梗死边缘区的过表达能够改善心功能并且增加周围组织心脏血管的密度.

(七)miRNA靶基因

miRNA是２１-２３个碱基长度的非编码小RNA,在心血管病的病理进程中起了重要作用.通过腺相关病毒转入RNA以提升起到治疗作用的miRNA 水平或转入短发夹RNA 和小干扰RNA 造成基因沉默,降低引起不良效应的miRNA水平,目前在基础研究中已经得到实现.通过AAV９转入miR-１会明显减轻主动脉缩窄大鼠的心肌肥厚和心功能不全.通过AAV９转入miR-３７８也会明显减轻主动脉缩窄小鼠的心肌肥厚和心功能不全.在心肌梗死小鼠和主动脉缩窄小鼠,miR-３４上调,注射miR-３４的抑制剂(AntimiR-３４)则明显改善心功能.在主动脉缩窄后的小鼠和临床心力衰竭患者,miR-２５上调.上调的miR-２５通过抑制SERCA２a的作用,促进心功能不全的发生.通过AAV９使得miR-２５过表达明显降低心脏收缩功能,通过注射miR-２５的抑制剂(AntimiR-２５)则明显延缓心力衰竭进展.以miR-NA为基础的基因治疗效果目前还没有来自大型实验动物的报道,未来也还有待临床试验进一步验证其疗效.

载体的选择

靶基因起作用需要通过各种载体的运输到达目的细胞后起作用,因此载体有效性的选择对于基因治疗的有效性作用也是不可忽略的一道屏障.目前,虽然有少数研究尝试使用裸病毒,但这种情况下,带负电荷的DNA链难以穿透同样带负电荷的细胞膜,并且裸DNA极易被各种酶降解,导致难以持久稳定表达,效率低下.因此,绝大多数基因治疗的研究均使用载体传递目的基因.广义上下面介绍几种常用的病毒载体和非病毒载体.

(一)非病毒载体

在非病毒载体中,主要应用的是裸质粒DNA和脂质体.裸质粒DNA可以直接注射至治疗区,其优点是可以相对容易的大量制备,没有DNA片段长度的限制,引起细胞及宿主的免疫反应相对较轻,但是其进入细胞并行使功能的效率偏低,大多持续３~４周,具有一定的免疫原性.脂质体是一种带有电荷的脂质颗粒包裹的DNA,能够与细胞的磷脂表面融合,进入细胞,转染效率比裸DNA高,并能携带较大的DNA 分子,缺点是脂质体的不断积累能够引起毒性,目前主要在肿瘤和囊性纤维病的治疗中应用.总的来说,非病毒载体虽然更加安全,但转染效率很低,靶向差,大多仅用于局部给药.

目前,出现了一种新的非病毒载体的方法用于基因治疗,这种方法是基于使用核酸修饰过的mRNA(被称为mo-dRNAs).modRNAs与传统的未修饰核酸一样,不能与Toll样受体结合,在转染过程中不引起机体的固有免疫反应,因此可以在体外反复注射.此外,mRNA 只需要直接在胞质内翻译即可,不需要整合至宿主的核酸中.因此modR-NAs能够引起短时的高效率的靶基因过表达,一般持续时间为２~６d.Turbell等研究发现用纳米微粒载体包装后的modRNAs,在直接心肌注射后在２０min后即可在大鼠和猪的心脏中检测到有靶基因的表达.

(二)病毒载体

病毒载体主要包括反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、腺相关病毒等.相对于非病毒载体,病毒载体的转染效率明显高得多,但是存在免疫反应问题.

各种病毒载体都有自己的局限性,目前为止,绝大多数的心血管疾病的基因治疗实验都是使用腺病毒载体进行.腺病毒可以对绝大多数的细胞类型进行感染,其中包括心肌细胞,转染后能够得到较高的靶基因的表达,但是其表达是一过性的(一般持续１~４周);腺病毒载体最主要的缺点是能够引起较强烈的固有免疫反应,因此限制了其在基因治疗中的广泛应用.

慢病毒载体是基因治疗的另一种载体,其引起的免疫反应较为温和,与其他病毒载体相比较,其优点是能够转染终末分化细胞(包括心肌细胞),慢病毒转染后的靶基因表达是稳定持续的表达,其特点是能够将包装好的靶基因整合入宿主的基因组中.但是其缺点是其对心血管系统的细胞(特别是心肌细胞)缺乏特异性的趋向性,需要通过心肌组织内注射的方法来实现心肌细胞的转染.基于安全性的考虑,慢病毒载体目前还未能在心力衰竭的基因治疗的临床实验中使用.

另外一种具有应用前景的病毒载体是腺相关病毒(AAVs),腺相关病毒(AAV)是一种细小病毒,仅含有单链的病毒DNA,转染效率较腺病毒更高.自从Ran等从金黄色葡萄球菌中筛选出分子量约为3.2kb的相对较小的SaCas９(Staphylococcus aureus Cas９)后,使得靶基因包装入AAV载体变为可能,从而可以进一步实现在体细胞编辑.经过重组后,能够仅含有治疗基因,因此致瘤性很低,是一种很有前景的选择.重组后的腺相关病毒(AAVs)能够转染有丝分裂细胞及终末分化细胞,rAAVs不需要与宿主的基因组整合,并且能够稳定持续的表达.并且运用腺相关病毒作为载体来进行基因治疗的优点是有些亚型的腺相关病毒对于心肌细胞具有趋向性,因此,腺相关病毒在心力衰竭的基因治疗中,是非常理想的基因转移系统.现有的Ⅱ期临床试验,均使用腺相关病毒.腺相关病毒有１３个血清型,其中AAV１、AAV６、AAV８和AAV９对骨骼肌和心肌的趋向性最高.在CUPID的临床实验中,在＞３００个的患者中均未能检测到细胞免疫反应,但是值得注意的是,一些患者中(８０％的病例来源于东欧)机体中本来存在的针对于该种病毒载体的中和抗体的滴度却明显升高,限制了腺相关病毒在所有人群中的广泛使用.尽管存在这些问题,rAAVs病毒载体依然是心力衰竭靶基因治疗中最具有前景的病毒载体.

(三)心肌特异性启动子

近些年来,心肌特异性的启动子如MHC启动子,MLC启动子及肌钙蛋白T 的启动子使靶基因的表达限制在心脏,同时疾病特异性的启动子例如ANF(心力衰竭时大量表达)启动子在动物实验中已经开始运用,虽然这些能够使靶基因特异性的在心脏组织表达,但是其表达的强度明显弱于常规持续性表达的启动子,并且需要高浓度的病毒载体.可诱导的启动子已经在动物实验中使用,该种启动子可以被药物或者小分子蛋白激活或者沉默.

基因传递方法的选择

选定目的基因和载体后,还需要有合适的基因传递方法,以确保基因治疗主要针对衰竭心脏,转染进足够多的心肌细胞或心脏其他细胞,获得足够长的疗效.关于基因传递方法,主要有血管腔内转移和直接注射两种方式.

(一)血管腔内转移

１.冠状动脉内导管基因传递是目前最常用的方法,也是最有临床推广价值的心脏基因转导技术.已有诸多实验证实,利用此技术转移目的基因的有效性及安全性.以常规冠状动脉内导管方法进行基因转导注射时,可以发现所转入基因主要在左心室表达,右心室没有表达或者表达水平很低.而对于以右侧心力衰竭为主要表现的动物模型,可通过冠状动脉右主干注射目的基因以获得满意的表达水平.其转移效率受到动物类型、导管及载体的生物相容性、晶体溶液的使用、高冠状动脉流率、暴露时间、病毒浓度和温度的影响.单纯冠状动脉输注可能无效,需结合其他辅助措施来提高转导效率,如提高血管床通透性、增加灌注压及提高细胞与心室充分接触的时间等.目前已有一些研究通过阻断管状静脉窦增加载体在血管内停留时间、逆行灌注及建立再循环的闭环系统,从而达到提高转移效率的目的.近来有研究试图应用基因洗脱支架来达到基因传递的目的.

２.静脉逆灌注在噬齿类动物实验中,高浓度的病毒载体可通过静脉逆灌注进行有效转导.但是由于人体较大的血容量,将导致到达心肌的病毒载体有效浓度得到稀释,而过高浓度的病毒载体又将引发转导的安全性问题.一些使用大型动物的实验证实,应用心肌趋向性腺病毒相关性载体可有效转导目标基因.

(二)直接注射

１.直接心肌注射直接心肌注射是目前研究较为充分的一种基因转导方式,但此方法只能在注射的局部及其周围获得较为令人满意的表达,而且除非利用极细的针头,这种基因转导方法均会造成心肌组织不同程度的损伤.

２.心包腔内注射其原理为心包及心肌层解剖结构相比邻及心包腔内注射相对较易实现病毒载体的传递.经过心包腔内注射,所转入基因可分布到约４０％的心肌表面,尤其在左心室前壁及室间隔可以获得满意表达,但心内膜下转染少,如同时输注胶原酶和透明质酸酶,有助于通过心包层细胞内及细胞间质的屏障,增加心内膜下转染.

３.心室内注射通过心室内注射技术可以在动物模型上获得最活跃的目的基因表达,这些研究均通过钳夹主动脉和(或)肺动脉以获得尽可能长的转染时间.主动脉和肺动脉交叉钳夹技术,可减少回心血量,左心室舒张末压基本不升,使静脉灌注在较低血流压力下进行,病毒能有效进入心内膜,并且目标基因较少在肝、肺等其他非靶脏器表达,但此方法不利于心肌保护.

临床试验进展

目前心力衰竭基因治疗的临床试验主要针对SERCA２a、SDF-１和AC６展开.在过去的一年,关于SERCA２a、SDF-１和AC６的Ⅱ期临床试验结果相继公布,虽然在部分指标出现良性变化,但总体结果令人失望,这三项研究均未能延续基因治疗在Ⅰ期试验和临床前试验中的良好势头,但亦未发现明显安全性问题.

(一)SERCA２a靶基因治疗的临床试验

迄今为止,使用AAV１.SERCA２a的临床试验有３个:第一个是CUPID系列临床试验.CUPID的Ⅰ期试验是第一个在人体上开展的心力衰竭基因治疗.第二个临床试验是AGENTＧHF(NCT０１９６６８８７)临床试验,使用的靶基因及载体是AAV１-CMV-SERCA２a.该试验为单中心、随机、双盲安慰剂对照实验;第三个临床试验是SERCAＧLVAD(NCT００５３４７０３)临床试验,该试验是在接受了左心室辅助装置的心力衰竭患者中运用AAV-１-SERCA２a的基因治疗心力衰竭,该试验为评估基因治疗后左心室辅助装置的心力衰竭患者是否能够在远期使患者脱离左心室辅助装置.CUPID系列临床试验研究是针对晚期心力衰竭患者进行AAV１.SERCA２a(商用名MYDICAR)基因治疗的系列临床试验.从２００９年报道了Ⅰ期临床试验结果以来,至２０１６年已完成Ⅱ期.２００９年公布的一项针对晚期心力衰竭患者所做的Ⅰ/Ⅱ期CUPID研究观察了AAV１包装的人SERCA２a治疗晚期心力衰竭的效果.该研究纳入了９例慢性心衰患者,心功能NYHA分级Ⅲ/Ⅳ级,LVEF ≤３０％,受试者随机分配至３个AAV１.SERCA２a中的一个剂量组,持续观察１２个月,在治疗６个月后进行了初步分析,５名患者症状得到改善,４名患者机体功能得到改善,２名患者生物标记物指标(NT-proBNP)得到改善,６名患者左心室功能或左心室重构获得改善,１名患者病情出现恶化.另外２名患者因体内已经存在病毒载体的抗体,因而病情未出现好转.更为重要的是,MYDICAR在试验中表现出较好的安全性.

２０１１年完成的CUPID Ⅱ期是双盲、随机、安慰剂对照的临床研究,其范围扩大至３９例晚期心力衰竭患者,受试者随机分配至３个AAV１.SERCA２a中的一个剂量组或安慰剂对照组,经单次冠脉内注射进行干预.大剂量治疗组在治疗６个月和１２个月后,症状好转,运动能力提高,NT-proBNP水平降低,左心室主张末期容积下降.此外,所有AAV１.SERCA２a干预患者在治疗后６个月和１２个月均出现运动能力改善,心血管事件发生率降低,慢性心力衰竭相关的住院率下降.

２０１４年报道的CUPID Ⅱ期临床研究是２０１１年该研究的延续,针对的是单次AAV１.SERCA２a治疗后随访３年的情况.该研究发现,各基因治疗组在死亡率、心力衰竭加重情况、心力衰竭相关的住院率、心脏移植和左心室辅助装置的需求均有不同程度的下降,其中在大剂量治疗组最为明显,后者的心血管事件复发风险较安慰剂对照组下降了８２％.大剂量治疗组所有患者所转染入的SERCA２a基因在患者体内仍存在.AAV１.SERCA２a治疗所有治疗组均显示了较好的安全性.

２０１６年公布的CUPID Ⅱb期是双盲、随机、安慰剂对照、多国、多中心的研究,从１０个国家招募了２５０名中度到重度心力衰竭患者.每位患者至少随访１年,平均随访１７.５个月.该研究的一级终点是复发(因心力衰竭恶化需入院或门诊治疗),二级终点是初次终点事件(全因死亡、心脏移植或置入机械循环辅助装置).基因治疗组患者的一级和二级终点与对照组相比均未出现改善,无安全性问题报告.因而,CUPID Ⅱb期临床试验的结果是阴性的,未能证实能够改善心力衰竭患者的预后.有鉴于此,AGENT-HF和SERCA-LVAD 这两个原本紧接其后的临床试验被暂停,等待CUPID２期实验的结果数据全面开放分析后,才可能继续进行.以上试验未达预期效果可能与载体选择、给药频率、给药途径,甚至是种族、性别、年龄等因素相关.另外,SERCA２a临床前探索都是在青壮年动物完成临床前实验,但临床试验多是招募病情较严重或年龄较大的患者,而此时钙循环改善等局部变化可能不足以提升整体运动功能.受试者也可能因为其他生理结构老化或恶化太快,超过治疗获益程度,导致临床效果不显著.

(二)SDFＧ１靶基因的临床试验

针对于SDF-１靶基因的临床试验有两个:STOP-HF及RETRO-HF临床试验.STOP-HF Ⅱ期临床试验为随机、双盲、安慰剂对照研究,评估SDF-１基因治疗在LVEF＜４０％的缺血性心力衰竭患者中的安全性和有效性.SDF-１质粒经过１５次的心内膜心肌注射.SDF-１质粒使用了两种不同的浓度(１５mg和３０mg),一级终点是治疗４个月后患者的６min运动耐量和明尼苏达生活质量调查表评分改变.结果显示两个治疗组与安慰剂组间未见明显差异.而在LVEF＜２６％的心力衰竭患者中,３０mg剂量的SDF-１质粒能够将LVEF提高１１％,这种结果在治疗一年后仍然存在,即使SDF-１基因在注入１个月后几乎就不再表达.RETRO-HF研究是将SDF１质粒逆向灌注入心肌组织内,该研究目前还在进行中,其研究结果令人期待.如果RETRO-HF研究也显示对LVEF较低的人群有效,将有力支持STOP-HF研究中SDF-１针对特定人群部分起效的结果.

(三)其他已进行的基因治疗临床试验

AC６基因治疗心力衰竭(AC６gene transferfor CHF NCT ００７８７０５９),其途径是通过冠状动脉内给药的方式,在治疗４周和１２周后评估其治疗心力衰竭患者有效性和安全性.一级终点是治疗４周和８周后患者运动耐量、心超LVEF值和左心室压最大上升/下降速率(dp/dt).结果显示给药组与安慰剂组间的运动耐量未见明显差异.但治疗后４周LVEF在治疗组比安慰剂组为高,而到了１２周两组又无统计学差异.在治疗后４周,左心室压最大下降速率(－dp/dt)在给药组好于安慰剂组,但左心室压最大上升速率(＋dp/dt)无统计学差异.安全性方面,未发现AC６致心律失常的证据.总的来说,需要扩大样本量来进一步证实AC６基因治疗的有效性和安全性.

此外,鉴于AAV９-S１００A１在临床前期大动物实验中取得了良好的结果,在未来的几年内,第一个S１００A１靶基因的治疗人体临床试验即将开展.另一个正在计划中的临床试验是使用rAAV２i８作为载体,该载体具有高度的心脏趋向性,靶基因是蛋白磷酸酶１抑制因子-１,该临床试验计划使用四种不同剂量AAV包装后靶基因来治疗心力衰竭.

问题和展望

虽然心力衰竭的基因治疗无论在动物实验还是临床试验中都取得了可观的成就,展示了具有革命性和突破性的成果,但也存在着诸多问题.

首先,由于细胞生理环境和生命周期非常复杂,对于基因治疗来说,其效果并不能保持很长时间,导致患者也可能需要接受多个疗程的治疗.虽然有的研究通过加大治疗剂量来达到使相关基因长期表达和细胞较长时间存活分化的效果,但加大剂量的长期安全性仍有待设计相关临床试验来阐明.

其次,人体的免疫系统功能强大,对外来的基因具有很强的排斥性,不但降低了治疗效力,还给重复治疗带来了困难.病毒载体的选择,也是治疗中遇到的一大问题.如何寻找低毒、低免疫原性、高特异性的载体和干细胞,是研究者们努力的一个方向.

再次,在实际治疗中,许多疾病都是多基因致病,如高血压、糖尿病等,目前的基因治疗还远不能有效地治疗这类疾病.通过调控多个基因进行多基因联合治疗(如SERCA２a和SUMO１)最近已经在小鼠身上取得成效.近年来通过转入数种转录因子,使得成纤维细胞转变为心肌样细胞也获得了成功.这些成果也为将来进行多基因联合干预的基因和细胞治疗指出了新的发展方向.由于实验动物和临床患者之间的物种差异性、实验条件和治疗方法的差别,迄今为止,在动物实验中取得的良好效果并不能满意延续到临床患者.甚至在动物实验和临床试验上,都出现了不少困惑甚至是完全相反的结论.如在CUPID临床试验结果出现的与前期动物实验不一致的结果,可能与AAVs病毒载体在不同物种间的感染率相关,同时,人群中的疾病背景也与前期动物实验不尽相同,这些可能都会影响到基因治疗中靶基因表达的有效性,同时,如何克服AAV病毒载体在一部分人群中引起的中和抗体的升高也是今后需要克服的一大障碍,这些基因治疗中出现的问题都提示了基因治疗需要更进一步精细调控的复杂性和必要性.

目前基因治疗大部分仍停留在动物实验阶段,且取得了可喜的成果,用于临床研究的基因治疗仍处在起步阶段,其有效性及安全性仍需进一步验证,因而距离临床常规应用也只是踏出了万里长征的第一步.尽管如此,这些临床试验的成果必将为心血管病基因治疗提供更多更新更有价值的参考.随着高特异性载体的不断出现,基因表达精准调控的不断实现及３D打印、CRISPR/Cas９在体基因组编辑技术,以及外泌体(exosome)介导的基因传递和细胞间信号传递等新技术和新概念的不断涌现,基因治疗势必在心力衰竭的治疗方案中占据一席之地.