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成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序

已有 5137 次阅读 2015-8-2 13:49 |系统分类:科研笔记

成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序

 

溶液配方:

1. 无糖无钙台氏液NT=

 

MW(分子量)

mM

g/100mL

g/600mL

g/L

g/2L

NaCl

58.44

136

0.795

4.7687

7.94784

15.8957

KCl

74.55

5.4

0.0403

0.2416

0.4026

0.8052

MgCl2

95.21

1

0.0095

0.0571

0.0952

0.1904

HEPES

238.3

10

0.2383

1.4298

2.383

4.766

NaH2PO4.2H2O

155.98

0.33

0.0052

0.0309

0.0515

0.103

去离子水

 

 

100mL

600mL

1000mL

2000mL

2. 无钙台氏液NT(-)NT=)配制

 

MW(分子量)

mM

g/200mL

g/300mL

g/500mL

g/400mL

Glucose

180.16

10

0.3603

0.5405

0.9009

0.7206

BDM

101.1

10

0.2022

0.3033

0.5055

0.4044

3. 酶解液(E液):NT(-) + 胶原酶2 + 蛋白酶+BSA

30mL NT(-)+30mg collagenaseⅡ(以275U/mg计算) + 3mg protease + 30mg BSA

4. 酶解洗脱液(DE)NT(-)+BSA

50ml NT(-) + 50mgBSA

5. 上机检测液(T液):NT=+ D-葡萄糖+ 1.8mMCaCl2

300mL母液 + 0.54g D-葡萄糖 + 0.06g CaCl2 (1mol/l,0.54ml)

6. CaCl2溶液: 1M CaCl2   0.2M CaCl2

复钙液 CaCl2溶液(0.2M):10 mL CaCl2=0.22gCaCl2+10mL

复钙终浓度为1.8mM,根据细胞悬液体积计算:

如细胞悬液体积40mL,含钙:40mL*1.8mM=0.072mM;每次加CaCl240μL,其中含钙 40*0.2=0.008mM共加:0.072/0.008=9次,

0  —  0.2  —  0.4 —   0.6 —  0.8 — 1.0— 1.4 — 1.8mM

40mL + 40μL  + 40μL  + 40μL +  40μL + 40μL+80μL+80μL  0.2M CaCl2

 

 

实验步骤:

一、清洗心腔血液

1. SD大鼠腹腔注射5000 U/kg 的肝素,10 min , 1% 戊巴比妥钠麻醉, 迅速开胸取心, 立即放入50mL氧饱和的 4℃无钙NT(-)液中,初步洗去心腔中血液,然后把心脏放入盛50mL氧饱和的 4℃无钙NT(-)液的培养皿中继续洗去心腔余血,同时持吸有NT(-)液的注射器并把主动脉套于有乳胶套的针头上,针头端部不能进入主动脉瓣,血管夹夹紧主动脉口,挂于langendorf灌流装置上,并用丝线结扎固定(如图AB所示)。用50mL37℃无钙NT(-)液灌流心脏至液滴无色,流速为6 ml/min


二、酶解心肌组织

2. 30mL 37℃酶解液灌流约33min至心脏变软,颜色变白。

三、洗脱消化酶,停止酶解

3. 消化酶洗脱液50mL37℃灌流约5min,取下心脏,置无菌40mL消化酶洗脱液。

 

四、复钙

4. 每隔5min.向溶液中加入分别40μL40μL40μL40μL40μL80μL80μL无菌0.2M CaCl2溶液。(此时Ca2+浓度为1.8mM

5.单细胞收缩系统检测心肌细胞收缩功能或收集细胞2.5%戊二醛固定。

6. 上机检测液洗两次,暗室中负载Fura-2 AM Ca2+荧光探针染色500μL 台式液加1μL DMSO溶解的Fura-2 AM Ca2+荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀,15min之后上仪器检测。

 

注意事项:

1. 心脏灌流液中不能有Ca2+,因为Ca2+抑制心肌细胞分离,减少细胞收益率。

2.  心肌细胞分离溶液中不要加入EGTAEDTA,它们均是Ca2+螯合剂,它们会损害心肌细胞和抑制酶活性。

3.溶液的PH=7.35

4. 如果动物小,心脏酶解时间应缩短。

5. 一次性吸管端部要钝化。

6. 双层纱布过滤心肌细胞。

7. 为了延长细胞的寿命,心肌细胞应该保存于4-8℃的环境中。

8. 可用0.4%的台盼蓝(用0.01M PBS配制)染色,用血球计数板计数并求得存活率。

9. 可用50g 离心5min沉淀细胞。

10. 高浓度酶溶液或长时间酶解都会损伤细胞质膜和膜整合受体。

11. 固定刚分离的心肌细胞可以先用洗脱液除去死去的细胞再固定。

12.所有溶液都要用O2饱和。

13.洗掉心脏血液的为4℃的O2饱和无钙台式液。

 

 

KB   现用现配(不用过滤)  PH=7.3KOH调节)(分离心肌细胞保存液,可以使心肌细胞保存约24h,且保持活性)

 

mM

MW

g/L

g/100mL

g/200mL

KOH

90

56

5.04

0.504

1.008

L-Glu

70

147.03

10.2991

1.0299

2.0598

KCL

30

74.5

2.235

0.2235

0.447

KH2PO4

10

135.98

1.3598

0.13598

0.2719

MgCL2·6H2O

0.5

203.3

0.1017

0.01017

0.02034

Hepes

10

238

2.383

0.2383

0.4766

Glucose

11

198.17

2.1799

0.21799

0.4359

EGTA

0.5

380.36

0.19018

0.01902

0.03804

 




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1 陆绮

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