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科学随笔:核酸体外扩增及核酸检测那些事儿 精选

已有 5181 次阅读 2020-6-18 13:39 |个人分类:科普文章|系统分类:科普集锦| 核酸检测, PCR

在大自然这个天然实验室里,病毒无处不在,并不断进化,不知什么时候就会跳出来危害一下人类。人类对付病毒,首先要识别它,抓住它。

相比于细菌等微生物,病毒要小的多,一般只有50-100纳米,高倍的电子显微镜,也不容易看请它们的真面貌。但借助于分子生物学的检测手段,对它们进行寻踪早已不是难事。

严格来讲,病毒并不算是真正的生命,它们没有细胞结构,离开生命体不能自我复制,但具有复制生命所必须的核酸。人类不仅搞清了核酸这种特殊生命大分子的结构,及其在体内的作用方式,也掌握了在体外对核酸进行复制增殖操作的一些高超本领。

每种生命都包含不一样的遗传大分子,即核酸,或DNA, 或RNA,抓住了特异的核酸,就抓住了病毒。微量核酸抓着费劲,但借助复制它的神器,问题就容易解决了。

COVID-19疫情爆发,伴随核酸检测这个反复出现的名词和实际发生的事实,RT-PCR、qPCR这些专业术语也更多出现在公众的视野中。可能有必要稍微作些了解,消除一些误解。

学过相关专业知识的,PCR(聚合酶链式扩增反应)都不陌生,但对于普通人肯定不好理解,听名字就够难记的。其实也没有必要了解太多,记住扩增两个字就可以了,还有,这个过程需要一些特殊条件和酶的参与。

提起PCR这个技术,脑海中就会闪现“变性、退火、延伸”这些名词,以及相关画面。变性-退火-延伸也正是描述核酸体外扩增的基本过程。双链的DNA高温(93摄氏度)下变性,解链成单链,目的是让其与互补的引物DNA结合,退火(温度降到55摄氏度)后,模板DNA与引物根据碱基配对原则进行杂交。后边的延伸过程简单来说,就是在DNA聚合酶和中间反应原料(dNTP)的参与和稍高温度下,实现DNA连续的半保留复制。整个温度和酶控的过程,现在都可以由仪器自动完成,操作起来比较方便。

新冠病毒属于单链RNA病毒,不稳定,需要通过逆转录酶,以RNA为模板合成cDNA(从RNA到DNA反向转录的DNA),然后以其为模板,扩增合成目的片段,这就是人们所说的RT-PCR核酸检测技术(逆转录核酸扩增),这个技术在RNA病毒检测上应用比较广泛,扩增后结合探针(一段人工合成的碱基序列)荧光标记(qPCR)等,就可以准确识别靶标。

应该说,PCR技术已经不算什么新玩意儿,从上世纪八九十年代开始,技术已逐渐成熟,更好用的工具酶的不断发现和筛选,加上技术的不断改进,大面积应用也有几十年时间。我们熟悉的亲子鉴定,通过DNA比对锁定罪犯,还有DNA考古,等等,都离不开PCR这个超级神器。抓个病毒更不在话下了。

基于PCR的核酸检测也不是什么很新鲜的技术。但的确,只有在这次不同寻常的疫情爆发后,它才真正进入大众的视野。

涉及大量人群的病毒病源学检测,使得核酸检测这几个字不断深入人心。病毒核酸,阴性还是阳性,希望和失望,从来没有像今天这样牵动着人们的神经。记得2003年SARS时,媒体并没怎么提到需要通过核酸检测作为确诊依据,主要原因是SARS的症状比较典型,通过临床症状和影像学检查,基本就可以定性,不需要借助病源学检测这个武器。关键是,SARS没有这么多隐形感染者。

追踪病毒的还有另一种方式,即血清免疫学检查,需要采血测抗体,主要看以往感染的情况,结果的不确定性相对复杂,抗体产生的滞后,也需要发病后一段时间才能检测到。核酸检测看起来相对单纯,只要能搞到含有病毒核酸的微量样本,只要是合格的试剂,规范的操作,抓住病毒的概率就应该比较高,所以,利用RT-PCR技术进行病毒核酸检测,特异性应该没有大问题(不需要整个的核酸,只需要其中一个片段,即靶标,就可以了)。至于灵敏性保证,看具体情况。

人们普遍关心假阴性的产生,一方面与样品受限有关(没有取到有病毒或者病毒载量过低的组织样本),或者试剂不太合格,灵敏度低,如造成逆转录的起始DNA含量太低。还有人提出,如果病毒变异了,正好涉及那段靶标,也可能检测不出来,但我觉得这种可能性不大。据知情人讲,我们的检测试剂有很多种,大多数是靠得住的。不合格的试剂能随便上市应用吗?估计很快被淘汰了。

当然,通过核酸检测可以确认病毒的存在,至于它是不是活着(具有感染力),还无法判断。所以要结合临床症状和其他检查来确定。

COVID-19,较多的无症状和不典型症状人群的存在,真的让核酸检测在疫情防控和患者确诊中发挥了史无前例的作用。如果没有核酸检测这个武器,无法及时筛查到感染人群,不能采取有效干预手段,结果可想而知。

人类科技的进步,总会在对抗疾病,对抗自然界敌人入侵中发挥越来越重要的作用。相信科学,依靠科学,我们一定可以找到更多与大自然抗衡的有力武器,当然,我发自内心的想法是,最好,我们能找到更多方法,与大自然和谐相处,不要有太多的杀戮。我们能做到吗?





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