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带你细看我是如何用LCM技术把癌细胞从来组织中拽出来的 精选

已有 4275 次阅读 2017-12-4 09:56 |个人分类:科普文章|系统分类:科普集锦|关键词:分子病理| 分子病理

        作者: 王孝养   (美国VitroVivo Biotech公司)


        从组织里把某一类或某一个细胞拽出来有不少方法,最常用的是把组织剪碎、消化、再培养,然后用磁珠或流式细胞仪Sorting出来。这个方法的好处是,可以分离出活细胞。缺点是,经过这么一折腾,细胞已经不是组织里的原始状态,而且如果没有好的表面抗原Marker,也sorting 不出来,此外,做sorting的流式细胞仪器还很贵的。由此看来,从组织中拽出原汁原味的细胞,还是激光捕获显微切割(LCM)方法管用。LCM可以用𣲙冻组织,也可以用存档的福尔马林固定的石碏包埋(FFPE)组织。这里以我最近做病人前列腺癌针刺活检标本为例,一步一步的告诉你,我们们是如何把微小的针刺活检组织里面的癌细胞给拽出了来的。

标本的来源

  前列腺的标本是从病人的前列腺通过超声引导针刺活检取得的,直径大约一毫米。

制作用于LCM的冰冻切片和染色

  活检下来的标本用OCT进行包埋,瞧一瞧是不是很小?要把这么小的标本平展的切下来并摊在玻片上并不是件容易的事,有时候标本包埋得不平就会切成一节一节的而不是整个长条形的,这样就增加了LCM的难度和劳动量。

  这就是我用来做冰冻切片的MICROM德国产的冰冻切片机,这可是世界上最好的冰冻切片机。

  做激光微切选玻片也非常重要,一般的玻片有三种:左边的第一种是平片,就是没有放任何粘合剂的普通显微镜用的玻璃片;第二种,就中间的那一张,Pen Membrane Glass Slide, 也就是在玻璃片上帖了一层专用PET 膜。第三种是金属框的Pen Membrane片,冰冻片的LCM三种片子都可以用,但玻璃平片最价廉物美。

  切好的片子可以直接做快速H&E染色,也可快速地在干冰里冻起来,然后存到负80度的冰箱作为下次再用。千万别让切下的冰冻组织在玻片上干了,这样会粘得很紧,LCM后很难拽下来。因为下游做RNA提取,每一步记得防RNase处理噢,染色尽量快些,可减少RNA的降解。

激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection,LCM)

  我们用的LCM系统是现在世界上最先进的Arcturus XT 系统。可以发射两种激光:IR和UV激光。高质量的Nikon倒置显微镜可看普通显微图像,也可看荧光显微图像,可用于普通H&E染色后的LCM,也可以用于荧光免疫染色后的LCM。

  如果片子上显示多数为癌细胞,极少纤维母细胞,我们只需切除纤维组织,把其余组织用干净刀片从玻片上刮下来即可用于提RNA。如果癌细胞少于80%,用IR激光把癌细胞拽出了更好些。

  IR激光微切下来的细胞被溶在LCM盖子的膜里。可根据需要来决定要切多少细胞。我们这个课题是准备把切下的癌细胞提取RNA,用于做PCR array。

从LCM盖子上提取RNA

        LCM盖子里面的RNA用Thermo Fisher提供的试剂合提RNA,课题要求RNA总量为100ng。

  提取的RNA用NanoDrop 测浓度和纯度。RNA质量可通过跑RNA电泳进一步确定, 或用Biochip analysis (Agilent or Biorad devices)来分析检测。

提取的RNA能干什么用?

  提取的RNA根据需要有好多用途噢,比如:

1)  RT-PCR或者定量PCR

2)  RNA测序

3)PCR array

4)  cDNA array

       这个课题的RNA主要是做PCR array,希望找出癌细胞和正常细胞之间的基因和信号途径的差异,为精准治疗提供靶向分子依据。




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1 黄永义

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