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[转载]质粒抽提的那些事

已有 6153 次阅读 2011-8-14 15:23 |个人分类:生物技术|系统分类:科研笔记|文章来源:转载

所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点:如何去除 RNA,如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开,如何去除蛋白质及其它杂质。

去除 RNA 相对比较简单,首先是使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。经过 RNase 消化后,RNA 变得比较小了,其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得 RNA,则需要更烦琐的操作。

将质粒与细菌基因组 DNA 分开,基本上是采用两种办法:一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌,在抽提时只让质粒从细菌中释放出来,而不让基因组 DNA 从细菌中出来,从而将质粒和基因组 DNA 分开;二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌,让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来,再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现,将质粒与基因组 DNA 分开。

去除蛋白质及其它杂质,基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是,依据不同的细菌,不同的培养条件,以及操作时的精细程度等,杂质的残留量会不同。所以,通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。

经过上面的处理,沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验,如转染,则需要做进一步的纯化,如 CsCl 超离心。

 

实验前方法/试剂的选择 

首选方法是碱裂解法。如果有问题,或者是大质粒 (>15 kb),则用温和的方法 SDS 裂解法。详细情况见分子克隆。试剂盒几乎都使用碱裂解法,所以都有一个通病,抽提大质粒时效果不好。

关于碱裂解法

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广,快速,纯度高等特点。当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性;不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就成为不可逆的了 (电泳时在超螺旋前面一点点,如果有一条带,就是此变性的质粒。)。所以,要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间。(似乎可以做这么一个推理:在碱性条件下,质粒的两条链从一点或者几个点开始分开,随着时间的延长,直到完全分开。理论上讲,完全分开的两条链要很快地配对复性,成功率肯定不可能是 100%的,而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性) 碱裂解法不适合大质粒的抽提,原因也是因为该方法太剧烈,使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法,缺点是得率要低一些。现在得问题是,大质粒的拷贝数本来就低,如果抽提方法得率再不高的话,抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中,超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低,随着粘稠度的增加而减低这个现象,完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的:增加试剂的使用量,使加入NaOH/SDS液后,溶液在1分钟内就能变得很清澈;立即加入中和试剂。

 

质粒抽提的 8 大窍门

1:摇菌时间。过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况。如果出现了问题,调整培养时间会有帮助:Nick 多,则增加培养时间;酶切出现问题,则减少培养时间。

2:起始菌体量。大家习惯说从多少 ml 菌液中抽提质粒,但一定要养成每次都观察菌体量的习惯,因为质粒毕竟是在菌体中,而且,抽提质粒所用的试剂量,都只与菌体量有关。

3:菌体的彻底悬浮。如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在溶液 II 加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源。

4:使用相对过量的试剂。这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是:稳定性好,纯度高,操作更简单。如果认为这样不经济,就少用一点菌体。

5:裂解时间。加入溶液 II 后,混匀,体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了,马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈,下次少用一点菌液,或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了,奇怪的现象也越来越多,而所有的奇怪现象,多与裂解时间有关。

6:中和的操作。在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后,先颠倒两次,使管底朝上,用指头弹击管底数次,再颠倒混匀。效果非常好。

7:中和后的离心去蛋白。一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面,继续离心的效果并不好;而将上清倒入另外一个离心管中,再离心,效果要好许多。

 

降低 RNA 残留的方法

RNA 的去除,首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml),或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒,都可以降低 RNA 残留,但都不能彻底去除。幸运的是,RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留,可以用试剂盒,或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase

 

降低 gDNA 残留的方法

gDNA 的残留问题,必须在抽提过程中解决,否则,就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大,越难于复性,也就越容易被去除;所以,一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越粘稠,gDNA 越容易被扯断;操作手法越重,gDNA 也越容易被打断。温和操作,使用相对过剩的试剂,是降低 gDNA 残留的最好方法。

 

降低蛋白质残留的方法

蛋白质的去除,主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于4℃一段时间,可以形成更多的该不溶复合物,从而使蛋白质残留更少,但实践证明这样做并不是必须的,除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮,加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的,蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平;而只有溶液的用量足够,甚至过剩,才能确保裂解和中和是彻底的。当然,试剂盒及苯酚的使用,是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

 

降低质粒 Nick 的方法

细菌收获时间,菌株的选择,抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早,质粒还在复制过程中,Nick 的比例较高;过晚,细菌开始死亡,杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌,会出现较高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作,也可以导致一些 Nick,但影响不会比前两者大。

 

降低变性超螺旋的方法

理论上,用碱裂解法抽提质粒,变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意,一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响,二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液,在加入溶液 II 后,体系能在 1 分钟内变澄清,再快速加入溶液 III,这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。)

 

关于质粒多聚体

QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察:从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19),电泳能发现很多条带;但使用单酶切后,仍然变成一条带,大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察,可以推理如下:那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒在一起形成的,而不是我的一条链与你的一条链复性在一起;第二,这种只是部分的,否则酶切会有问题;第三,这种是脆弱的,线性后的刚性足以打破它。如果是这样,质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关,可以不管它(也管不了),因为它不影响酶切,或者说,即使质粒多聚体切不动,也不会影响太大。总之,碰到这种情况,不要简单地认为有问题,而是应该一步一步往下做,但一定要做完一步,检测一次,看一看结果与预期的吻合程度。

 

提高得率的方法

利用氯霉素抑制染色体的复制,而不抑制质粒的复制这一特点,在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。 

 

为什么酶切后质粒总是降解?

酶切后质粒降解的原因很多,但如果用实验方法排除了质粒的质量及酶的质量因素后 ( A 酶能成功,用 B 酶失败,但 B 酶能成功用于其它质粒。),仍然不能解决此问题,就只能从质粒的构造上去找原因了。

 

为什么质粒抽提得率低  

伴随有 RNA 污染:菌体过量、RNase A 失效。 起始菌体过量是导致抽提失败的最主要素。菌体过量将导致的问题有:得率低 (RNA 与质粒 DNA 竞争吸附)RNA 污染 (RNase A 相对量不足,不能在规定时间内降解所有的 RNA),超螺旋比例低 (菌体过量使溶液非常粘稠,为混匀溶液所需要的外力很容易破坏超螺旋)。确保成功的关键是:如果从 1.5 ml 菌液中抽提出来的质粒足够实验所需,绝对不要使用 3.0 ml 起始菌液。

在实验操作过程中,下列现象提示菌体过量:

加入 P2 混匀,静置 2 分钟后,如果溶液没有变成透明,或者溶液看起来虽然已经变成透明,但转动离心管时发现溶液太粘稠或者不均匀。

加入 P3 后,不能完全混匀,有大块物形成。离心时很难使之离至管底。  

没有 RNA 污染:将上清移入吸附柱时,吸入了絮状蛋白质。如果在步骤 4“将上清移入吸附柱”操作中,吸入了絮状蛋白质,那么,离心时絮状蛋白质将覆盖在吸附膜的表面,离心时难将液体离下。在加入 T1 洗脱时,将发现 T1 不能很快渗入吸附膜中,而是一直处在吸附膜表面。此时用一个干净的吸嘴轻轻在吸附膜的表面来回划几次可以使 T1 进入吸附膜中,这时可能出现两种情况:最终获得 DNA,但伴随蛋白质的污染;仍然没有多少 DNA。蛋白质污染的可能后果是酶切时 DNA 出现非特异降解。   

 

质量低  

基因组 DNA 污染:可能的原因有三:加入 P2 后室温放置时间超过4分钟、加入 P2 P3 后混匀动作不温和,菌体过量。

RNA 污染:菌体过量、RNase A 失效。

超螺旋比例太低:加入P2后室温放置时间超过5分钟、加入P2P3后混匀动作不温和,宿主菌含内源核酶,菌体过量。

酶切产物弥散:抽提所得的质粒被蛋白质污染,内切酶被污染。

 

样品上柱后离心不下去  

样品中有大量蛋白质污染。  

所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点:如何去除 RNA,如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开,如何去除蛋白质及其它杂质。

去除 RNA 相对比较简单,首先是使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。经过 RNase 消化后,RNA 变得比较小了,其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得 RNA,则需要更烦琐的操作。

将质粒与细菌基因组 DNA 分开,基本上是采用两种办法:一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌,在抽提时只让质粒从细菌中释放出来,而不让基因组 DNA 从细菌中出来,从而将质粒和基因组 DNA 分开;二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌,让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来,再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现,将质粒与基因组 DNA 分开。

去除蛋白质及其它杂质,基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是,依据不同的细菌,不同的培养条件,以及操作时的精细程度等,杂质的残留量会不同。所以,通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。

经过上面的处理,沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。如果要用于更高级的实验,如转染,则需要做进一步的纯化,如 CsCl 超离心。

 

实验前方法/试剂的选择 

首选方法是碱裂解法。如果有问题,或者是大质粒 (>15 kb),则用温和的方法 SDS 裂解法。详细情况见分子克隆。试剂盒几乎都使用碱裂解法,所以都有一个通病,抽提大质粒时效果不好。

关于碱裂解法

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高,适用面广,快速,纯度高等特点。当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性;不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法,质粒在碱性条件下会变性,时间一长,这种变性就成为不可逆的了 (电泳时在超螺旋前面一点点,如果有一条带,就是此变性的质粒。)。所以,要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间。(似乎可以做这么一个推理:在碱性条件下,质粒的两条链从一点或者几个点开始分开,随着时间的延长,直到完全分开。理论上讲,完全分开的两条链要很快地配对复性,成功率肯定不可能是 100%的,而没有完全分开的两条链却完全可能 100% 配对复性) 碱裂解法不适合大质粒的抽提,原因也是因为该方法太剧烈,使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法,缺点是得率要低一些。现在得问题是,大质粒的拷贝数本来就低,如果抽提方法得率再不高的话,抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中,超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低,随着粘稠度的增加而减低这个现象,完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的:增加试剂的使用量,使加入NaOH/SDS液后,溶液在1分钟内就能变得很清澈;立即加入中和试剂。

 

质粒抽提的 8 大窍门

1:摇菌时间。过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况。如果出现了问题,调整培养时间会有帮助:Nick 多,则增加培养时间;酶切出现问题,则减少培养时间。

2:起始菌体量。大家习惯说从多少 ml 菌液中抽提质粒,但一定要养成每次都观察菌体量的习惯,因为质粒毕竟是在菌体中,而且,抽提质粒所用的试剂量,都只与菌体量有关。

3:菌体的彻底悬浮。如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在溶液 II 加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源。

4:使用相对过量的试剂。这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是:稳定性好,纯度高,操作更简单。如果认为这样不经济,就少用一点菌体。

5:裂解时间。加入溶液 II 后,混匀,体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了,马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈,下次少用一点菌液,或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了,奇怪的现象也越来越多,而所有的奇怪现象,多与裂解时间有关。

6:中和的操作。在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后,先颠倒两次,使管底朝上,用指头弹击管底数次,再颠倒混匀。效果非常好。

7:中和后的离心去蛋白。一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面,继续离心的效果并不好;而将上清倒入另外一个离心管中,再离心,效果要好许多。

 

降低 RNA 残留的方法

RNA 的去除,首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml),或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒,都可以降低 RNA 残留,但都不能彻底去除。幸运的是,RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留,可以用试剂盒,或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase

 

降低 gDNA 残留的方法

gDNA 的残留问题,必须在抽提过程中解决,否则,就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大,越难于复性,也就越容易被去除;所以,一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越粘稠,gDNA 越容易被扯断;操作手法越重,gDNA 也越容易被打断。温和操作,使用相对过剩的试剂,是降低 gDNA 残留的最好方法。

 

降低蛋白质残留的方法

蛋白质的去除,主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于4℃一段时间,可以形成更多的该不溶复合物,从而使蛋白质残留更少,但实践证明这样做并不是必须的,除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮,加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的,蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平;而只有溶液的用量足够,甚至过剩,才能确保裂解和中和是彻底的。当然,试剂盒及苯酚的使用,是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

 

降低质粒 Nick 的方法

细菌收获时间,菌株的选择,抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早,质粒还在复制过程中,Nick 的比例较高;过晚,细菌开始死亡,杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌,会出现较高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作,也可以导致一些 Nick,但影响不会比前两者大。

 

降低变性超螺旋的方法

理论上,用碱裂解法抽提质粒,变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意,一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响,二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液,在加入溶液 II 后,体系能在 1 分钟内变澄清,再快速加入溶液 III,这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。)

 

关于质粒多聚体

QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察:从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19),电泳能发现很多条带;但使用单酶切后,仍然变成一条带,大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察,可以推理如下:那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒在一起形成的,而不是我的一条链与你的一条链复性在一起;第二,这种只是部分的,否则酶切会有问题;第三,这种是脆弱的,线性后的刚性足以打破它。如果是这样,质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关,可以不管它(也管不了),因为它不影响酶切,或者说,即使质粒多聚体切不动,也不会影响太大。总之,碰到这种情况,不要简单地认为有问题,而是应该一步一步往下做,但一定要做完一步,检测一次,看一看结果与预期的吻合程度。

 

提高得率的方法

利用氯霉素抑制染色体的复制,而不抑制质粒的复制这一特点,在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。 

 

为什么酶切后质粒总是降解?

酶切后质粒降解的原因很多,但如果用实验方法排除了质粒的质量及酶的质量因素后 ( A 酶能成功,用 B 酶失败,但 B 酶能成功用于其它质粒。),仍然不能解决此问题,就只能从质粒的构造上去找原因了。

 

为什么质粒抽提得率低  

伴随有 RNA 污染:菌体过量、RNase A 失效。 起始菌体过量是导致抽提失败的最主要素。菌体过量将导致的问题有:得率低 (RNA 与质粒 DNA 竞争吸附)RNA 污染 (RNase A 相对量不足,不能在规定时间内降解所有的 RNA),超螺旋比例低 (菌体过量使溶液非常粘稠,为混匀溶液所需要的外力很容易破坏超螺旋)。确保成功的关键是:如果从 1.5 ml 菌液中抽提出来的质粒足够实验所需,绝对不要使用 3.0 ml 起始菌液。

在实验操作过程中,下列现象提示菌体过量:

加入 P2 混匀,静置 2 分钟后,如果溶液没有变成透明,或者溶液看起来虽然已经变成透明,但转动离心管时发现溶液太粘稠或者不均匀。

加入 P3 后,不能完全混匀,有大块物形成。离心时很难使之离至管底。  

没有 RNA 污染:将上清移入吸附柱时,吸入了絮状蛋白质。如果在步骤 4“将上清移入吸附柱”操作中,吸入了絮状蛋白质,那么,离心时絮状蛋白质将覆盖在吸附膜的表面,离心时难将液体离下。在加入 T1 洗脱时,将发现 T1 不能很快渗入吸附膜中,而是一直处在吸附膜表面。此时用一个干净的吸嘴轻轻在吸附膜的表面来回划几次可以使 T1 进入吸附膜中,这时可能出现两种情况:最终获得 DNA,但伴随蛋白质的污染;仍然没有多少 DNA。蛋白质污染的可能后果是酶切时 DNA 出现非特异降解。   

 

质量低  

基因组 DNA 污染:可能的原因有三:加入 P2 后室温放置时间超过4分钟、加入 P2 P3 后混匀动作不温和,菌体过量。

RNA 污染:菌体过量、RNase A 失效。

超螺旋比例太低:加入P2后室温放置时间超过5分钟、加入P2P3后混匀动作不温和,宿主菌含内源核酶,菌体过量。

酶切产物弥散:抽提所得的质粒被蛋白质污染,内切酶被污染。

 

样品上柱后离心不下去  

样品中有大量蛋白质污染。  



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1 施泽明

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