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如何创新改造疫苗---一点个人经历分享 精选

已有 3153 次阅读 2020-12-25 14:48 |系统分类:科普集锦

二十多年前,曾经受邀面试辉瑞公司的生物医学部,主要研究方向就是疫苗,看到mRNA疫苗通过FDA的批准,让我有许多感叹,辉瑞公司需要与德国的BioN公司合作,也可见辉瑞的生物医学部的实力还不太强。


回顾当年那段疫苗经历,有点重生的感觉,若干年前后,我在博士母校校友年会上做了一次演讲,会后研究中心主任邀请我加盟开实验室,因主持医院的领导工作外加睡眠医学中心,已经没有时间埋头实验室了。当年有一个梦,回国教书,教授肿瘤和粘膜免疫,那个年代,没有背景人脉很难找到位置的。08年回国,我将全套幻灯带在身边,可惜竟找不到一个交流机会与同学们分享,在此就不多说了,以下我将从背景,思路,方法和结果,科普一下这段疫苗改造创新的经历。


九十年代,核酸疫苗非常火爆,绝大部分人不知道的是,默克公司曾经做过一个核酸疫苗的临床试验,但悄无声息的失败了。当时疫苗领域的头面人物,见到我们的项目,给予了很高的评价,认为是这个领域的一个突破,差不多同一个时间里,mRNA疫苗出现了,也是令人非常惊艳的。


介绍一下我的背景,当年工作的实验室曾经是一个叫JERRY MCGEE下面的一个小组,粘膜免疫是免疫大领域里的一个分支,JERRY MCGEE开创了这个分支,可以说是开山鼻祖,他退休后,这个小组来到蒙大拿专职开发粘膜免疫疫苗。粘膜免疫学科是研究粘膜里的免疫系统及其免疫反应的,他手下有两个小组,一个是做疫苗开发,另一个是做免疫耐受的,其特殊之处在于粘膜免疫反应的分析,其独特的粘膜系统实验方法,可以说是独门利器。当年并不知道那么多,一位芬兰朋友告诉我这个实验室是世界上粘膜免疫最顶尖的之一,是JERRY MCGEE的嫡传。


那个年代,艾滋病肆虐,除了血制品传播外,有许多是经性交粘膜传播的,如果能诱导粘膜免疫反应,是否能阻断艾滋病的传播?这是研制粘膜免疫载体的第一个思路。其实在我们实验室里有各种疫苗载体包括佐剂蛋白,腺病毒,细菌载体等等,而当时波士顿儿童医院的一个小组的工作引起了注意,将病毒抗体包装成微粒后,经胃肠道诱导了很好的粘膜抗体免疫反应,而抗病毒细胞免疫反应要差得多。活性载体如腺病毒细菌载体效率非常好,然而副作用毒性却很大,而佐剂蛋白及微粒包装副作用不大,然而效率却很低,能否做出一个载体,既有活性载体的高效率,又能将毒性副作用降到最小,这是研制课题的第二个思路。


最初的设想是用微粒包裹核酸,再点缀上导向蛋白,由导向蛋白将微粒导向粘膜淋巴系统的激发节点。那么选择制取导向蛋白及微粒便成了关键的两步。


先说说导向蛋白的选择,呼肠孤病毒(REOVIRUS)对于粘膜淋巴系统的节点如肠道的PEYER’s PATCH有极强的吸附,是通过外包裹的病毒σ1蛋白,这个蛋白便成了我们的首要选择,如何制取却大费周折。记得国内上课的生化教授打趣说,基因工程可以让一克蛋白产生一公斤黄金的价值,当年让我很是神往,这也是我当年出国求学的初衷之一,可当真正操作制取时才知道黄金难炼。大致程序是找一个细菌表达系统,将病毒基因克隆进去,养细菌造病毒蛋白,可是细菌养好了,蛋白却提取不了,原来病毒σ1蛋白是个三聚体,必须在细菌培养的早期某个阶段,用某种浓度盐溶剂,将蛋白溶成单体才能提取,而且一不当心就聚合失去活性,经过无数次摸索才掌握窍门,其中的挫折和艰辛可想而知。


如何将核酸包装进微粒,为什么要包装成微粒?这里有一个口腔消化道的生理背景。消化道粘膜表面有一层粘液,食物颗粒如何吸收转运是非常复杂的,当年有一篇文章,分析出粒子的大小有直接关系,太大太小都不行,这么点东西就发了科学杂志。如果要诱导粘膜免疫反应,微粒载体大小是非常重要的。记得波士顿儿童医院提供了protocol,其中一个超声波制取微粒的仪器,我们实验室并无类似设备,我就和高年资技术员一起想办法,土法上马利用实验室一台超声波细菌破壁机做声源,虽然效率差了一些,最终制取出微粒,整个过程还是非常好玩有趣的。


接下来便是体外细胞实验和动物模型实验,忙活了几个月终于将初期设想做出来了,然而进一步的实验却大出所料。首先是体外细胞的毒性很大,大片的细胞死亡,动物实验,小鼠的毒性也很大,实际测出的粘膜免疫抗体滴度并不高,小鼠非常不健康,而且也有死亡的,让我很失望,一度陷入深思,当时卫生研究院给出期限,如果三到六个月没有结果的,这个项目就放弃了。


日思夜想,连做梦都在思考,灵光一现,让我想到了基因治疗,其中有一个受体介导的基因转入。于是,我将σ1蛋白联到多聚赖氨酸上,再利用多聚赖氨酸的极性去包裹核酸,这样一个粘膜核酸载体就做成了,体外细胞实验很成功,接下去的动物实验还是出现了挫折,经口腔肠道的反应很不理想,而再次经鼻粘膜的诱导取得了很大成功,不但诱导出粘膜抗体免疫反应,还诱导出理论上不太可能出现的细胞免疫反应,这里可以看出口腔肠道生理的复杂性,对微粒大小有很高的要求,而鼻黏膜却完全不一样。


这个粘膜核酸载体得到国家卫生研究院另一个小组的重复和证实,那年在华盛顿一个重要年会上受到高度关注,也受到许多质疑,其中有争议的是细胞免疫反应,当时理论上不太可能出现的现象,也说明黏膜免疫机理有许多未知之处,瑞典的科学家(Current Opinion in Immunology Volume 14, Issue 5, 1 October 2002, Pages 666-672)认为这是首次用非活性载体诱导出类似活性载体,如病毒细菌,的黏膜免疫反应,意义重大,并对机理进行了探讨。这篇工作本来准备投自然杂志,但由于机理不明,实验设计要求不同,最后被PNAS接受 M cell-targeted DNA vaccinationPNAS July 31, 2001 98 (16) 9318-9323,我曾经收到两位院士的评论信,一直收藏至今。十三年后,我在医院查房,无意收到一个信息,原来这个工作被2013年自然杂志关于粘膜免疫领域进展综述再次提及(Mucosal Immunology volume 6pages666677(2013),让我感慨不已,那段时日是我家庭和经济最拮据的时日,却是我人生中最闪光的一段时日。

 

 

 

 




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