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狂犬病毒的“非洲起源说”受到挑战(４)
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狂犬病毒的“非洲起源说”受到挑战(4)
关于现存的丽沙病毒的起源，“非洲起源说”一直占统治地位。在非洲热带地区，发现了较多种类的丽沙病毒，它们具有更大的遗传多样性，而且它们之间缺乏抗体交叉反应，因而产生了非洲热带地区是丽沙病毒发源地的假设。但这个观点现在面临着挑战。
新西兰和英国的研究人员2016年共同发表的研究论文对狂犬病毒的上述“非洲起源说”提出了挑战。他们的研究结果支持了丽沙病毒的古北区起源（Palearctic origin，古北区，包括欧洲和亚洲北部、非洲北部）。他们的论文的题目是“The Global Phylogeography of Lyssaviruses - Challenging the ’Out of Africa’ Hypothesis（丽沙病毒的全球系统发生地理学——挑战“走出非洲”的假说）”，发表在《 PLoS Negl Trop Dis（公共科学图书馆：被忽视的热带病》杂志（见参考文献）。
现将该论文的主要内容分几部分陆续进行介绍。
（１）摘要、前言（狂犬病毒的“非洲起源说”受到挑战(1) ）
（２）方法（狂犬病毒的“非洲起源说”受到挑战(２) ）
（３）结果 (狂犬病毒的“非洲起源说”受到挑战(3))
（４）讨论
尽管在非洲热带地区发现了高度多样性的丽沙病毒，我们的分析支持了丽沙病毒的古北区起源(PP = 0.85)。大多数情况下相关概率的支持度很高，表明丽沙病毒的进化具有很强的地理和时间框架，正如RABV在陆生食肉动物中所证明的那样。我们对现存丽沙病毒的起源时间的估计取决于我们是使用一个固定的进化速率还是使用一个宽松的分子钟来估计速率。但这并不影响系统生物地理学根据这种分析来估算物种之间进化关系的准确性(图1和2)。这些分析拒绝假设丽沙病毒曾经作为蝙蝠来源的病毒在非洲出现，而是假定曾发生从古北区到非洲热带地区传播的三个不同的事件(图1)。
目前的遗传谱系(PG1-3)具有地志学（topological）的支持，每个谱系（PG）都具有单系起源(图1)。支持度较低的PG 3包含物种IKOV、LLEBV和WCBV。PG 2具有单一的非洲热带生态组合带（ecozone）范围，由SHIBV、MOKV和LBV组成。PG 1又细分为两个主要的世系（lineages），一个包含IRKV, EBLV-1和DUVV，另一个世系的丽沙病毒包括分布在古北区(ARAV, BBLV, KHUV和EBLV-2)，澳洲区(ABLV)，东洋区(GBLV)和美洲区(RABV)的各个种类。如果考虑WCBV和LLEBV (PG3)的宿主以及EBLV-1和DUVV (PG1)的潜在宿主，可能进一步提供上述病毒分布的机制。这些病毒中的每一种都在同一种蝙蝠属：长翼蝠属(Miniopterus)中被发现，因此这些蝙蝠可能在丽沙病毒在大陆间的传播中发挥了作用。这种蝙蝠属出现在非洲热带和古北区生态组合带，尽管像长翼蝠属小翅蝠（Miniopterus schreibersi）这样的物种以前被认为分布在这两个生态组合带，现在被认为有更复杂的分类，不一定是同一种蝙蝠。
在俄罗斯高加索地区， WCBV是从古北区物种长翼蝠（ Miniopterus schreibersi）中被分离出来，而LLEBV和EBLV-1是在西班牙被鉴定出来，在北非和欧亚大陆都有发生。目前尚未在非洲发现WCBV病毒，但在肯尼亚的非洲长翼蝠中发现了针对WCBV的特异性抗体，这可能为一种蝙蝠丽沙病毒在非洲和欧洲都流行提供了证据。没有证据表明WCBV和IKOV(与WCBV最密切相关的丽沙病毒)之间存在交叉中和作用，提示在肯尼亚的长翼蝠中检测到的抗体是WCBV特异性的。EBLV-1和DUVV之间遗传上的密切关系曾被用作病毒从非洲进入欧洲的证据。然而，在我们的分析中，我们观察到EBLV-1从古北区向非热带地区传播的证据更充分。EBLV-1和DUVV与IRKV(古北区)有共同的祖先，进一步强化了这一发现的说服力。从肯尼亚的叶鼻蝠（ Hipposideros vittatus）中分离出的 SHIBV 是首个从叶鼻蝠属中分离出的丽沙病毒。叶鼻蝠属在从热带非洲到中国的旧世界有广泛的分布，虽然像长翼蝠属一样，其中每一种蝙蝠都有一个更特殊的分布。在这个分类单元内进一步取样，将确定SHIBV是否已经从古北区跨越到非洲热带生态组合带，这可能正是来自WCBV和我们的分析已获得的有限数据的情况(图1)。
我们的结果通过对每个物种单个代表的完整基因组分析得到证实。尽管有强有力的证据支持我们的结论：丽沙病毒是从古北区开始传播,也应该认识到,分别从俄罗斯和西班牙分离得到的最不同的两种病毒,WCBV和 LLEBV,可能会影响这些发现，丽沙病毒属自己的祖先可能起源于古北区以外的地区,甚至在非洲热带生态组合带。RNA病毒之间的关系可能受到不同过程的影响，比如高进化率和随后的纯化选择。我们观察到，与其他病毒相比，EBLV-1每个位点的核苷酸替换减少。最早的EBLV-1序列出现于1968年，该序列取自较大的地理区域(从乌克兰到西班牙)，但EBLV-1的宿主范围有限。EBLV-1只在西班牙以外的大棕蝠(Eptesicus serotinus)中检测到。在西班牙，通过积极的调查已经报道了六种欧洲食虫蝙蝠，尽管大多数是E. sertinus。因此，未来的研究应该确定宿主限制是否降低了核苷酸取代率以及是通过什么机制实现。来自西班牙的数据可能是这种病毒向新的生态区位扩展并在此过程中遭遇遗传多样性减少瓶颈的证据。然而，在研究相对充分的蝙蝠丽沙病毒中，EBLV-2对多本顿蝙蝠(M. daubentonii)有更大的宿主限制和更窄的地理范围，所以我们估计的替代率降低可能是其他机制造成的。随着更多病毒，特别是来源于蝙蝠的病毒的更多全长基因组序列资料的出现，可以更好地推断出丽沙病毒的进化关系。我们强烈建议未来的研究目标是发现更多来自非洲、亚洲和古北地区东部的病毒。
从这个数据集观察到的其他重要的传播事件是从古北区到澳州区，以及在新北区和新热带生态组合带之间的双向传播。这些分析为丽沙病毒向东方传播提供了支持，从古北区向东到澳洲区，以及随后的伴随殖民化到达美洲。澳大利亚在其野生动物种群中没有发现RABV，只有偶尔输入的人类狂犬病病例，然而，从患病蝙蝠、人和对蝙蝠的监测中都分离到ABLV，这表明ABLV是持续存在的。事实上，两种截然不同的ABLV世系明显地流传着，一种现在已经从澳大利亚狐蝠科（Pteropodidae）的所有四种物种中分离出来，另一种来自一种食虫蝙蝠：黄翅足蝠（Saccolaimus flaviventris）。
2015年在斯里兰卡从狐蝠（Pteropus medius）中分离出GBLV具有重大意义，因为它与RABV的关系比目前发现的任何其他旧大陆丽沙病毒都更密切。考虑到丽沙病毒在生态组合带之间的传播，GBLV的储存宿主狐蝠 (P. medius)因多种原因而显得特别有趣。首先，ABLV已从澳大利亚所有4种狐蝠科蝙蝠中分离得到。其次，狐蝠属（Pteropus genus）的成员遍布亚洲和澳洲，为这两个生态组合带之间的传播提供了可能的机制。第三，亚洲蝙蝠群体中血清监测发现了丽沙病毒特异性抗体，但未分离到病毒。然而，ABLV的宿主S. flaviventris在巴布亚新几内亚也有报道，提示可能存在其他传播途径。
我们对RABV数据的分析为美洲组合带之间的传播提供了强有力的支持(图1)。这可能是由于两种并非互相排斥的机制造成的。一是尽管最近有证据表明宿主系统进化限制了病毒在美洲的种间传播，但仅在美国就有超过23种蝙蝠分离出RABV。物种变异的宿主特征是存在的，但适应性并不足以阻止丽沙病毒跨物种的传播。因此，RABV基因组的突变可能导致宿主限制减少，使得RABV在北美和南美的蝙蝠之间更容易传播。这一发现的另一个机制可能是宿主本身。在整个美洲都有高度群居的、数量众多的和/或迁徙的蝙蝠，如巴西犬吻蝠（Tadarida brasiliensis）、毛尾蝠（Lasiurus cinereus）和棕蝠（Eptesicus fuscus）。美洲的这些迁徙和广泛分布的蝙蝠种类可能已经使RABV在不同的生态组合带之间迅速传播，使得这种无节制传播的RABV能够迅速地利用未占据的生态区位。此外，在夏威夷和加拿大不列颠哥伦比亚省都发现了毛尾蝠（Lasiurus cinereus）。证明了一个迁徙物种如何可能是RABV的潜在宿主或便于解释RABV祖先是如何从古北区到达美洲的。
我们对分子钟的分析为以下假设提供了支持:在15世纪末欧洲人到来之前，RABV就已在美洲蝙蝠种群中传播。此前已经知道，西班牙征服者曾报告有蝙蝠袭击人类，美洲原住民知道烧烙术（cauterisation）可用于预防疾病的发展。GBLV和RABV的平均tMRCA（最近共同祖先存在的时间）是在7,000年前。RABV第一个内部分支的tMRCA中位数为3,726年前( 95% HPD，593 ~ 31,478)。我们在使用分子钟分析来解释RNA病毒的年龄时须非常谨慎，因为纯化选择对RNA病毒有影响，然而，纯化选择应该把我们的日期进一步推到更早，而不是把估计时间缩短。因此,我们有信心,我们的分析支持在欧洲人于公元1492年到来之前在美洲的蝙蝠中就可能存在RABV，因为我们的最低RABV tMRCA日期，按95% HPD 估算是公元1423年，而估计的中值是3726年前，即在公元前1710年。
目前对犬类中的RABV起源存在争议，系统进化分析质疑了古希腊文献中关于RABV的报道。我们的分析表明，几乎可以肯定，在这个时期丽沙病毒在古北区的蝙蝠中传播。同样，无论是像其他分析中那样使用宽松的分子钟来估计进化速率，还是采用固定进化速率，此时在美洲蝙蝠中似乎都有RABV的广泛传播。因此，从公元前23世纪报告的狂犬病病例可能是由于现存的RABV已经发生从蝙蝠到陆地食肉动物的溢出传播。未来对所有现存丽沙病毒的分析将有助于进一步阐明这些关系
最后，现存的翼手目蝙蝠可能起源于亚洲/欧洲，而且在美洲发现了较年轻的分枝。这种生物地理重建反映了与在丽沙病毒属中发现的相似的模式。然而，现存翼手目的分化时间是在数百万年左右，目前已知的有关蝙蝠和丽沙病毒之间协同物种形成的信息无法推断丽沙病毒可能的远古起源，而在以蝙蝠为宿主的其他病毒类群(例如冠状病毒和乳头瘤病毒)中却可以发现更古老的起源。
综上所述，我们的分析为丽沙病毒的单源的古北区起源并从此处扩散到世界其他地方的说法提供了支持。虽然三个传播事件的流向都是从古北区向非洲热带地区,但导致对动物和人类健康最大影响的传播事件是向东,正是从东方，RABV 毒种似乎已经逐渐进化并扩散到全球范围,导致每年23,000－ 93,000人的死亡。了解这种病毒而不是其他病毒在全球出现的原因，将有助于了解驱动病毒出现的过程。
参考文献：
１, WHO Expert Consultation on Rabies (Third report) , Geneva: WHO. (2018). https://apps.who.int/iris/handle/10665/272364.
２，The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers, Nature Reviews Microbiology，16:241–255 (2018).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6899062/pdf/nihms-1059081.pdf
3. The Global Phylogeography of Lyssaviruses-Challenging the ’Out of Africa’ Hypothesis. PLoS Negl Trop Dis (2016) 10(12): e0005266. doi:10.1371/journal.pntd.0005266
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