原名：Enhancing methanogenic fermentation of waste activated sludge viaisoelectric-point pretreatment: Insights from interfacial thermodynamics，electron transfer and microbial community

译名：利用等电点预处理以强化剩余污泥在厌氧条件下产甲烷的过程：界面热力学、电子转移及微生物群落

期刊：Water Research

IF：9.13

发表时间：2021.3

通讯作者：戴晓虎

通讯作者单位：同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室；上海市污染控制与生态安全研究院

       从位于江苏苏州的污水厂收集剩余污泥（WAS）。在实验室条件下，对剩余污泥进行30天的厌氧培养以获得用于产甲烷发酵的接种污泥。不同污泥样品的性质见表S1。pI测量和pI预处理见之前发表的文章以及附录文本S1和S2。不同pH条件下污泥的Zeta电位见图S1。经过pI处理的污泥样本为实验组（EG），未经pI预处理的污泥样本为对照组（CG）。

       通过为期170天的中温批次试验（37℃，120 rpm）研究了污泥的产甲烷发酵。每个污泥样品使用32个相同的血清瓶（250 mL），每个样品分为两组平行研究。每瓶以1:2的VS比投入接种污泥和基质。对EG组，包含156.8 g基质和72.4 g接种污泥；对CG组，包含176.9 g基质和72.4 g接种污泥；此外，以仅包含72.4 g接种污泥瓶子作为空白样。试验开始前，调节各瓶子中污泥的pH至7，并密封。试验期间，定期测量沼气中的甲烷含量及相应的NCMP值，并取出一定量污泥用于微生物群落分析。使用伪一阶和经过修饰的Gompertz动力学模型拟合前25天的甲烷净累积产量（NCMP）。通过接触角测量、电化学工作站等分析了污泥固液界面的热力学和电化学特性。根据前人研究计算了电子转移能力（ETC）、电子接受能力（EAC）、电子供给能力（EAC）、电导率（σ）、离子强度（μ）。通过高通量测序分析了污泥中细菌和古菌群落。采用标准方法测定了污泥样品的TS、VS/TS比值和主要多价金属含量（Al、Ca、Fe、Mg、Zn、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb）。通过Zetasizer测定了污泥的Zeta电位和σ值。通过马尔文粒径分析仪分析了污泥的粒径分布及D_f。通过气相色谱分析了VFA浓度。所有的测试均进行三次，所有的试验数据以平均值+标准差的形式表示。

1 沼气中甲烷的产生及其动力学研究

       收集产甲烷发酵前25天不同的污泥样品（EG和CG），其NCMP值如图1所示。NCMP从第0天增加到第20天，20天后无明显变化（P>0.05）。因此，研究发酵前25天的甲烷生成是合理的。此外，EG中的最大NCMP值为274.4±3.0 mL CH₄/g VS，是CG（123.5±2.5 mL CH₄/g VS）的两倍多，表明pI预处理显著提高了WAS的甲烷产量。如图1所示，尽管从第0天到第4天，EG和CG之间的NCMP没有显著差异，但在第4天之后，EG的NCMP始终高于CG。为了了解这两组之间的差异，采用伪一阶和修正的Gompertz模型拟合来自EG和CG的NCMP数据。前者通常用于描述NCMP数据，前提是水解是速率限制步骤，后者通常用于产甲烷菌的生长速率受某种抑制行为限制时。图1（a）和（b）分别显示了基于伪一阶模型和修正Gompertz模型的NCMP拟合曲线。表S3和S4（SM）总结了相应的动力学参数。如图1（a）和（b）所示，伪一阶模型（R²=0.9849，P<0.001）和修正的Gompertz模型（R²=0.9976，P<0.001）之间，CG的NCMP拟合系数（R²）没有显著差异，表明两个模型都能准确地描述CG的NCMP数据。两种模型模拟结果均较好的一个合理解释是，污泥水解是限速步骤，而产甲烷菌的生长速度也受到CG产甲烷发酵过程中污泥水解不良（抑制行为）的限制。因此，两种动力学模型都能准确地描述CG的NCMP数据。这一结果也与之前的研究结果一致。然而，对于EG，图1（a）和（b）表明，修正的Gompertz模型（R²=0.9972，P<0.001）拟合效果优于伪一级模型（R²=0.9376，P<0.001），这表明，在EG产甲烷过程中，产甲烷菌的生长速率是产甲烷反应的速率限制步骤，而不是污泥的水解速率。我们之前的研究结论也与这一结论相符。

图1 实验组（EG）和对照组（CG）的甲烷净累积产量（NCMP）及采用不同的动力学模型的拟合曲线：

（a）伪一级模型；（b）修正的Gompertz模型。误差线为SD。

       在先前的研究中，有研究者发现pI预处理显著增强了污泥的有机溶解、水解和酸化，因此，可以假设在EG产甲烷发酵期间，VFA的代谢率在短时间内（即滞后时间）低于其产生率，导致VFA累积。这种积累，在这段时间内，将反过来抑制产甲烷菌的生长。然而，随着发酵的继续，积累的VFA逐渐转化，导致NCMP显著增加（图1）。这一观点也与发酵期间EG和CG之间VFA浓度的差异一致（图S2，SM）。此外，由于改进的Gompertz模型适用于描述EG和CG的NCMP数据，因此该模型的动力学参数，如甲烷生成潜力（B₀）和最大甲烷生成速率（R_m）可用于比较分析EG和CG的甲烷生成潜力和速率。如表S4（SM）所述，EG中的R_m和B₀值分别为31.8±0.9和279.3±2.0 mL CH₄/g VS，是CG中相应值（分别为12.5±0.3和124.0±1.2 mL CH₄/gVS）的两倍以上，表明pI预处理不仅显著提高了产甲烷潜力，而且提高了产甲烷量。

        图2显示了产甲烷发酵过程中EG和CG沼气中甲烷比例的变化。EG沼气中甲烷的比例始终高于CG，表明在产甲烷发酵过程中，EG中更多的碳被转变为甲烷。这一结果表明，在产甲烷发酵过程中，pI预处理可能会改变微生物群落结构。如图2所示，尽管来自EG和CG的沼气中甲烷的比例都表现出最初增加然后稳定的趋势，但相应的值以不同的速率和程度增加。例如，在8天内，EG沼气中的甲烷比例从0快速增加到73.1±2.5%，而在16天之后，CG沼气中的甲烷比例从0缓慢增加到62.4±3.0%。换言之，pI预处理减少了WAS产甲烷发酵过程中沼气中甲烷含量稳定所需的时间，可能是通过显著提高甲烷产率实现的（图1和表S4，SM）。更重要的是，一旦稳定，CG沼气中甲烷的比例从61.8±2.0%到65.4±2.0%不等，平均值为63.4±1.3%，这与之前报道的结果一致。但EG产甲烷沼气中甲烷的比例较高，为69.3±2.5%～76.8±2.0%，平均为74.1±2.3%，说明pI预处理提高了沼气中甲烷的比例。对这一现象的一个合理解释是，pI预处理提高了氢营养型产甲烷菌的活性，促进了CO₂向CH₄的代谢还原，从而增加了沼气中甲烷的比例。

图2 产甲烷发酵过程中实验组（EG）和对照组（CG）沼气中甲烷比例的变化。误差线为SD。

        产甲烷发酵过程中污泥有机质产生甲烷通常取决于两个关键因素：（1）污泥有机质；（2）功能微生物。在产甲烷发酵系统中，这两个关键元素并非独自变化，而常通过电子转移在污泥的固液界面上相互关联。由以上结果，即pI预处理可显著提高产甲烷潜力、提高产甲烷率、提高产甲烷量、提高沼气中甲烷比例，我们假设pI预处理通过部分去除多价金属，增强污泥中自驱动的固液界面非共价相互作用，从而促进污泥中的电子转移，使产甲烷菌的相对丰度增加，从而增强了WAS中的NCMP。

2 污泥界面非共价相互作用能及电子转移

        为验证上述假设，研究了pI预处理对污泥产甲烷转化过程中固液界面非共价相互作用能和电子传递的影响。

        非共价相互作用（例如范德华、静电、氢键和疏水相互作用）在酶反应（例如产甲烷发酵）中尤其重要，尤其是在形成酶-底物二元复合物时。基于扩展的DLVO理论，污泥的典型固液界面非共价相互作用能主要由LW相互作用能（）、AB相互作用能（）和EL相互作用能（）组成。其中，非极性LW相互作用通常用来描述波动偶极诱导偶极的吸引相互作用，极性AB相互作用与疏水相互作用和水化压力密切相关，包括氢键驱动疏水吸引（）和水化驱动的亲水排斥（），而EL相互作用与极性液体中的颗粒分散或粘附直接相关。此外，IFE是和的总和，通常用于表征界面的亲水性或疏水性。

        图3使用箱线图描述产甲烷发酵期间EG和CG的、和值变化的统计分析结果。产甲烷发酵过程中EG和CG的界面LW、AB和EL相互作用能的变化分别如图S3、S4和S5所示（SM）。图S6和图S7分别展示了相同过程中EG和CG的IFE变化和估算的离子强度值（SM），并通过图S8（SM）中的箱线图总结了相应DF值变化。如图3所示，在污泥中的三种界面相互作用能中，在产甲烷发酵过程中绝对值最大，并且在EG和CG中变化最大，表明疏水相互作用和水合压力主导了固液界面的非共价相互作用污泥的分解。值得注意的是，EG中的和的波动程度大于CG中的和，表明EG中的疏水作用和水化压力以及范德华吸引作用都强于CG。这一发现表明，pI预处理通过引起氢键的波动和发酵过程中偶极诱导的偶极力，增强了污泥的自驱动固液界面非共价相互作用。对上述观察结果的一个合理解释是，pI预处理去除了大量多价金属，尤其是OBM（表S1，SM）。失去多价金属的影响，有机分子的原子周围电子云的密度增加，电子分布更容易波动，因此，由于电子密度的波动，偶极矩被读取并不断地移动，导致不同有机分子原子间偶极诱导偶极相互作用强度的大幅波动，并导致EG中污泥固液界面的值发生较大变化，因为有机分子的电子分布在没有多价金属的情况下更容易波动，所以水分子必须频繁地在质子供体和受体之间切换，以与有机分子相互作用，这将导致氢键相互作用强度的快速波动，并进一步导致EG中污泥固液界面上的值的大幅度变化。据报道，偶极子诱导的偶极子相互作用有助于确定酶与底物之间相互作用的特异性活性位点和底物，以及氢键相互作用可以提供酶-底物二元复合物的结合能。因此，在产甲烷发酵过程中，pI预处理通过促进偶极子诱导的偶极子和氢键相互作用来增强污泥的界面酶促反应是合理的。这也可能解释了为什么在产甲烷发酵过程中，pI预处理提高了甲烷的生产潜力和产率（图1）。

图3 实验组（EG）和对照组（CG）污泥样品在发酵过程中界面范德华（LW，）、Lewis酸碱（AB，）和静电（EL，）相互作用能变化的箱线图（对于EG，EG-LW，EG-AB和EG-EL代表，和；对于CG，CG-LW、CG-AB和CG-EL分别表示、和）。

红色和黑色实线分别表示平均值和中值；黑色实点表示异常值；

须表示最大值和最小值；每个箱子包含16个测量值及95%置信区间。

采用基于Storey’sfalse discovery ratecorrection的双尾Student's T test进行多重比较分析。

P<0.05被认为是显著的（***P<0.001）。

       仔细检查图3中值的变化，发现EG中污泥样品的大多数值为负值，发酵期间的平均值约为−4.08 mJ/m²；相反，CG中污泥样品的大多数值为正值，平均值为2.67 mJ/m²。这些结果表明，产甲烷发酵过程中，污泥表面的亲水性和疏水性在EG和CG中都发生了变化，EG中通常为疏水性，CG中通常为亲水性，说明pI预处理改变了污泥固液界面非共价相互作用的主要形式，由亲水排斥改为疏水牵引。可以得出结论，pI预处理通过在产甲烷发酵过程中引入氢键来增强污泥的固液界面疏水相互作用，这也与测量的IFE值一致（图S6，SM）。界面疏水相互作用通常可以提供酶促反应的驱动力，这表明pI预处理可以提高污泥有机物在固液界面的产甲烷发酵潜力。疏水相互作用是许多生物分子系统中不可或缺的组织力，并负责细胞膜和细胞内隔间的组装。因此，可以推断，在产甲烷发酵过程中，pI预处理还可以通过增强污泥固液界面的疏水相互作用来改变微生物代谢途径，这一点也被来自EG的沼气中甲烷比例明显增加所证实（图2）。另一个有趣的现象如图3所示，在产甲烷发酵过程中，在最小平衡距离（≈0.157nm）处，EG中的大多数值远高于CG中的值。例如，EG中的平均值为6.64±1.41 mJ/m²，是CG中（3.10±1.84 mJ/m²）的两倍多。这一结果表明，pI预处理显著增强了最小平衡距离处污泥颗粒之间的EL相互作用，导致传质和污泥分散增加（图S8，SM），这有利于酶（即蛋白质）等生物重要溶质的流动性，增加了溶质和污泥颗粒之间的接触。

        污泥的ETC和σ是评价产甲烷发酵过程中电子转移潜力和ETR的两个重要参数。一般来说，污泥的ETC值越高，电子转移电位越大，污泥的σ值越高通常表明ETR越大。CV曲线的还原峰电位（Ep-red）可以用来表征接受电子的能垒。在这里，较小的绝对E p-red值有利于还原反应，这取决于接受电子。图4通过箱线图描述了产甲烷发酵过程中， EG和CG的电子传递（ETC、EAC、EDC和σ）和Ep-red值的变化。这些参数变化的原始数据分别展示于图S9、S10和S11中。ETC值和IFE值之间的关系如图S12（SM）所示。如图4所示，EG组的平均ETC、EAC和EDC值高于CG组。例如，EG中的平均ETC值为11.10±1.65 mmol e⁻/g VS，高于CG中的平均ETC值（9.14±1.55 mmol e⁻/gVS），表明pI预处理提高了产甲烷发酵过程中污泥的电子转移电位。对于这一发现，可以考虑两种可能的解释。首先，pI预处理可以部分去除有机-金属络合物中的多价金属，从而增加了有机分子周围自由电子对的数目，从而提高了电子转移电位。这一解释与增加的LW相互作用能（图3）一致，它对应于由电子云涨落引起的偶极诱导偶极相互作用。其次，pI预处理增强了污泥表面的疏水性，形成了一个相对低密度的水区域，在疏水表面附近有一个开放的氢键网络。因此，自由电子对通过氢键的运动较少受到缺乏水分子的限制，从而导致电子转移电势增加。这一解释与图S12（SM）中ETC和IFE值之间的显著负相关（R=0.6114，P<0.01）一致，表明ETC随着污泥固液界面疏水性的增加而增加。这一结果也可以由先前的发现证实，即水分子可以对电子转移施加很大的障碍。如图4（a）所示，EG的平均σ值高于CG（3.9±0.6 mS/cm 和3.4±0.5 mS/cm），表明pI预处理通过产甲烷发酵提高了污泥的ETR，这可以用Marcus理论解释。这一理论表明多价金属能提高蛋白质生物电子转移的重组能，从而降低ETR。当多价金属被pI预处理部分去除时，重组能降低，ETR增大。基于以上结果，我们认为pI预处理提高了产甲烷发酵过程中污泥的电子转移效率（包括电子转移电位和ETR）。

图4 产甲烷发酵过程中实验组（EG）和对照组（CG）污泥样品的电子传递能力（ETC）、电子接受能力（EAC）和电子供给能力（EDC）变化的箱线图。

（a）EG和CG电导率（σ）的变化；（b）EG和CG还原峰电位的变化。

红色和黑色实线分别表示平均值和中值；黑色实点表示异常值；

须表示最大值和最小值；每个箱子包含16个测量值及95%置信区间。

采用基于Storey’s false discovery rate correction的双尾Student's T test进行多重比较分析。

P<0.05被认为是显著的（*P<0.05；**P<0.01）。

       有趣的是，从图4中可以发现，尽管EG的平均ETC和EAC值高于CG，但EG中这些值的波动较小。因此，pI预处理后，污泥的电子转移电位不仅增加，在整个产甲烷发酵过程中也更加稳定和可持续。图4（b）中的另一个有趣现象是，EG中污泥的平均绝对Ep-red值低于CG中，污泥的还原反应（即接受电子）在EG中更容易发生。这进一步支持了pI预处理的污泥有机材料在产甲烷发酵过程中接受电子的能力更强（图4中的EAC）。这也说明pI预处理后的污泥或有机物在产甲烷发酵过程中更容易接受电子。基于此，通过pI预处理可以提高微生物代谢对电子的利用效率。

3 IFE和ETC与甲烷日产量的关系

      为了进一步了解pI预处理是如何通过增强污泥的自驱动固液界面疏水作用和促进污泥的电子传递来提高WAS的NCMP，研究了IFE和ETC值与甲烷日产量的关系。

        图5（a）和图5（b）分别描述了IFE和ETC值与甲烷日产量的相关性。表S5和表S6分别总结了相应的主要参数（SM）。如图5（a）所示，当IFE从6.5±1.5 mJ/m²变为−28.6±1.0 mJ/m²时，甲烷的日产量呈上升趋势，表明在产甲烷发酵过程中，随着污泥表面由亲水性变为疏水性，甲烷的日产量增加。随后，通过相关分析证实了污泥表面的亲水性/疏水性与产甲烷发酵过程中的甲烷产量之间的潜在相关性。图5（a）显示了IFE值与每日甲烷产量数据之间的显著负相关（R>0.86，P<0.01），表明在污泥产甲烷发酵期间，高度疏水的污泥表面将提高每日甲烷产量。对这一观察结果的一种逻辑解释是，由于结构吸引力（即氢键驱动力和范德华吸引力），疏水性更强的污泥表面通常具有更强的疏水吸引力，驱动酶分子与底物接触，形成酶-底物二元复合物。更疏水的污泥表面使疏水吸引力更强，酶与底物络合的驱动力更强，从而增加甲烷的日产量。图5（b）显示了ETC值与甲烷日产量之间呈显著正相关（R>0.77，P<0.01），表明在污泥产甲烷发酵期间，高电子转移电位有利于每日甲烷产量。可以推测，污泥较高的电子转移电势有助于电子的利用，尤其有助于将CO₂还原为CH₄，从而促进污泥产甲烷发酵期间甲烷日产量的增加。此外，我们确定改善的ETC主要是由于污泥表面疏水性的增加（图S12，SM）。因此，pI预处理可以增强污泥的固液界面疏水性，提高污泥表面的疏水性，从而提高污泥的电子转移电位，增加甲烷的日产量。由于甲烷的生成与微生物在产甲烷转化中的作用密不可分，因此可以推断，pI预处理还通过增强固液界面疏水相互作用和提高污泥的电子转移电位来改变微生物群落结构。

图5 产甲烷发酵过程中，界面自由能（IFE）值和电子转移能力（ETC）值与甲烷日产量之间的线性相关：

（a）IFE值与甲烷日产量之间的负线性相关关系；

（b）ETC值与甲烷日产量数据之间的正线性相关关系。误差线表示SD。

4 微生物群落结构分析

       为了揭示pI预处理对甲烷发酵过程中EG和CG微生物群落结构的影响，研究了EG和CG的微生物多样性和微生物群落组成。

       Shannon和Simpson指数是衡量微生物α多样性（即物种均匀度和物种丰富度）的重要指标。Shannon指数越大，物种均匀度越高；Simpson指数越小，物种丰富度越高，物种均匀度越低。一般来说，物种均匀度水平与微生物多样性成正比。产甲烷发酵过程中EG和CG中细菌和古菌OTU水平的Shannon和Simpson指数变化的统计分析如图6所示。在产甲烷发酵过程中，对EG和CG在不同水平（即门、纲和属）的细菌和古细菌群落组成之间的差异进行统计分析的结果如图7和8所示。产甲烷发酵过程中EG和CG在门、类和属水平上的主要细菌和古细菌群落变化的原始数据分别如图S13和S14所示。图S15（SM）总结了主要氢营养型产甲烷菌（即Methanobac-terium属）和主要产甲基营养产甲烷菌（即Methanomassiliicoccales和Methanofastidiosum)属）相对丰度变化的统计分析。如图6（a）所示，EG中细菌OTU水平的Shannon指数和Simpson指数的平均值略低于CG，表明pI预处理导致污泥产甲烷发酵过程中细菌物种均匀度略有下降，物种丰富度略有增加。换言之，pI预处理略微降低了细菌多样性，这也通过分析细菌群落中的相对丰度得到了证实（图S13，SM）。图6（b）显示古细菌OTU水平的平均Shannon指数在EG中高于CG，表明pI预处理改善了古细菌物种的均匀性。EG的平均Simpson指数值低于CG，表明在污泥产甲烷发酵过程中，pI预处理后，古细菌物种均匀度增加，物种丰富度降低，即古细菌多样性增加。结果表明，在WAS产甲烷发酵过程中，pI预处理后细菌多样性降低，古细菌多样性增加。

图6 产甲烷发酵过程中，实验组（EG）和对照组（CG）微生物在OTU水平的Shannon指数和Simpson指数变化箱线图：

（a）细菌；（b）古细菌。

红色和黑色实线分别表示平均值和中值；黑色实点表示异常值；

须表示最大值和最小值；每个箱子包含10个测量值及95%置信区间。

        通过鉴定细菌群落组成（图S13，SM）和分析EG和CG之间鉴定的细菌群落组成的统计显著性差异（图7），揭示了pI预处理对细菌群落组成的影响。如图7（a）和S13（a）（SM）所示，在发酵产甲烷过程中，与复杂有机物降解（通过水解和酸化）有关的细菌门如Proteobacteria、Chloroflexi、Firmicutes和Actinobacteriota等，在 EG和CG中富集。然而，有趣的是，图7（a）揭示了这些细菌门的平均相对丰度（百分比）在EG和CG之间存在差异。产甲烷发酵过程中，EG组的平均Firmicutes比例（16.9±2.9%）显著高于CG组（11.7±5.9%），说明pI预处理显著增加了该门的相对丰度。据报道，Firmicutes在有机物的水解和酸化中具有重要的功能。因此，pI预处理可以通过增加产甲烷发酵过程中Firmicutes的相对丰度来消除污泥有机物水解的限速步骤。这一现象也可以解释pI预处理的甲烷生成动力学（图1）。根据图7（b）和S13（b）（SM），EG和CG的纲水平细菌群落主要由Anaerolineae（Chloroflexi）、Clostridia（Firmicutes）、Synergistia（Firmicutes）、Gammaproteobacteria（Proteobacteria）、Alphaproteobacteria（Proteobacteria）和Bacteroidia（Bacteroidetes）组成。由图7（b）注意到的一个问题是，EG中Clostridia（P<0.05）、Thermoleophilia（P<0.01）和Chloroflexia（P<0.05）的平均比例显著高于CG，表明pI预处理显著增加了这些类别的相对丰度。在产甲烷发酵过程中，Clostridia在EG和CG中的平均比例最大。据报道，Clostridia在WAS的厌氧水解过程中起着重要作用，这进一步表明pI预处理显著改善了产甲烷发酵过程中污泥有机物的水解。

图7 产甲烷发酵过程中，实验组（EG）和对照组（CG）在不同水平上的细菌群落存在显著差异：

（a）门水平；（b）纲水平；（c）属水平。

采用基于Storey’s false discovery rate correction的双尾Student's T test进行多重比较分析。

P<0.05被认为是显著的（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001）。

       此外，图7（c）和图S13（c）（SM）表明，除未知属的细菌外（即“others”），产甲烷发酵过程中EG和CG中相对丰度最高的细菌属是Thermovirga，其次是norank_f_norank_o_Aminicenantales和Romboutsia。值得注意的是，如图7（c）所示，EG中Romboutsia（P<0.01）、nonrank_f_JG30-KF-CM45（P<0.01）、Clostridium_sensus_stricto_1（P<0.05）和Rhodoplanes（P<0.0001）的平均占比显著高于CG，表明pI预处理对这些属的丰度有显著的有益作用。在产甲烷发酵过程中，Romboutsia所占的平均比例最大。据报道，Romboutsia利用葡萄糖和果糖作为生产乙酸、异丁酸和异戊酸等的唯一碳源。因此，pI预处理通过显著提高产甲烷菌的相对丰度促进了污泥有机质的酸化（P<0.01）。有趣的是，图7（c）表明，尽管Rhodoplanes的平均比例较低（<2%），但其丰度在EG和CG之间差异最大（P<0.0001）。Rhodoplanes是一种光合细菌，在厌氧环境中具有反硝化功能。因此，pI预处理可以支持在这样的环境中利用光合细菌进行反硝化。总的来说，pI预处理似乎改善了WAS产甲烷发酵过程中支持水解和酸化的功能菌群。

       图S14（SM）展示了pI预处理对EG和CG古菌群落组成的影响，并且各组间差异的统计评估如图8所示。因此，在产甲烷发酵过程中，Halobacterota、Euryarchaeota 和Thermoplasmatota均被确定为EG和CG中的优势古菌门。图8（a）表明，EG中的Euryarchaeota和Thermoplasmatota的平均比例高于CG（分别为43.2±12.0%和37.1±12.6%和3.1±2.1%与2.2±1.4%），表明pI预处理可改善产甲烷发酵过程中这些门的相对丰度。一般而言，除Methanosphaerastadtmaniae（H₂依赖型甲基营养微生物）物种外，已识别的Euryarchaeota产甲烷菌大多是hydrogenotrophs。此外，所有已鉴定的Thermoplasmatota产甲烷菌均为H₂依赖型产甲烷菌。因此，pI预处理可改善氢营养型产甲烷菌和H₂依赖型甲级营养产甲烷菌的相对丰度，并增强代谢反应4H₂+CO₂→CH₄+2H₂O，从而导致WAS产甲烷发酵过程中产生的沼气中甲烷的比例较高（图2）。

       在纲水平，如图8（b）和S14（b）（SM）所示，Methanosarcinia, Methanobacteria 和Thermococci被确定为EG和CG中的主要古菌纲，并且各组之间的平均相对丰度不同。例如，EG的平均相对丰度为32.7±6.9%，比CG高24.8%。如图所示8（c）和14（c）所示，产甲烷发酵过程中EG和CG中的古菌群落主要为Methanosaeta, Methanobacterium, Candidatus_Methanofastidiosumand Methanosarcina。然而，这些古菌群落的相对丰度在EG和CG之间存在差异（分别为38.7±13.5%、30.0±6.3%、10.6±8.0%和9.3±4.1%以及 42.5±11.7%、23.1±6.8%、10.9±8.7%和10.9±5.0%）。Methanosaeta 和Methanosarcina是典型的乙酰营养型产甲烷菌，Methanobacterium是典型的氢营养型产甲烷菌，Can- didatus_Methanofastidiosum是H₂依赖型甲基营养产甲烷菌。因此，在属水平上，主要乙酰营养型产甲烷菌的平均相对丰度（即Methanosaeta 和Methanosarcina）的平均相对丰度在EG中约为48%，在CG中约为53.4%，这一差异表明pI预处理抑制了乙酸分解为CH₄的代谢途径。或许，pI预处理增加了古菌多样性（图6（b））并提高了其他产甲烷菌的相对丰度（图S14和图S15，SM）。这也与EG和CG在属水平上主要氢营养型产甲烷菌（即甲烷）的平均相对丰度出现的差异一致。pI预处理后，主要氢营养型产甲烷菌的相对丰度增加了29.9%，表明污泥产甲烷发酵过程中CO₂向CH₄的还原作用增强。此外，图8（b）和（c）中的统计结果表明，EG中的Methanobacteria（Euryarchaeota，P<0.05）和Methanobacterium（Methanobacteria，P<0.05）的平均比例显著高于CG，说明pI预处理对WAS产甲烷发酵过程中这些类群有显著的促进作用，进一步证实了pI预处理显著提高了WAS产甲烷发酵过程中氢营养型产甲烷菌的相对丰度。

图8 产甲烷发酵过程中，实验组（EG）和对照组（CG）的古菌群落在不同水平上存在显著差异：

（a）门水平；（b）类群水平；（c）属水平。

采用基于Storey’s false discovery rate correction的双尾Student's T test进行多重比较分析。

P<0.05被认为是显著的（* P<0.05）。

5 IFE和ETC与产甲烷菌主要属相对丰度的关系

       为了进一步了解pI预处理通过增强自驱动固液界面疏水相互作用，促进污泥中电子转移改变产甲烷菌群落结构，探讨了IFE和ETC与产甲烷菌主要属相对丰度的关系。

       图9和图10中分析了IFE和ETC与乙酰营养型产甲烷菌（Methanosaeta和Methanosarcina）和氢营养型产甲烷菌（(Methanobacterium）相对丰度的相关性。表S7-S10（SM）总结了相应的主要参数。如图9所示，随着IFE从正值变为负值，乙酰营养型和氢营养型产甲烷菌的相对丰度呈现出增加的趋势，表明污泥表面的疏水化增加了这两种生物的相对丰度。因此，疏水污泥表面有利于产甲烷菌属的富集。相关分析证实了这一可能性，结果表明，图9（a）中主要的乙酰营养产甲烷菌的IFE值与主要的产甲烷菌的相对丰度之间分别存在显著的负相关（R>0.74、P<0.01和R>0.64，P<0.01）。因此，可以得出结论：产甲烷发酵过程中，主要的乙酰营养型和氢营养型产甲烷菌倾向于优先聚集在疏水污泥表面，这也可以解释为什么高度疏水的污泥表面促进产甲烷发酵期间的甲烷日产量（图5）。对于这种发现，一个逻辑解释是疏水表面通常对微生物具有很强的疏水吸引力（即吸引结构力）（图3），这有利于微生物粘附。相反，亲水表面通常具有强亲水排斥（图3），这有利于微生物分散。在营养浓度较低的水生环境中，例如产甲烷发酵过程中的污泥，表面附着微生物通常比游离细胞更具化学活性。因此，在WAS产甲烷发酵过程中，疏水污泥表面含有相对较大的主要活性乙酰营养型和氢营养型产甲烷菌种群。

图9 产甲烷发酵过程中主要产甲烷菌属的相对丰度与界面自由能（IFE）值呈负线性相关：

（a）乙酰营养型产甲烷菌；（b）氢营养型产甲烷菌。误差线表示SD。

图10 产甲烷菌转化过程中电子转移能力（ETC）值与主要产甲烷菌属相对丰度的线性关系：

（a）乙酰营养型产甲烷菌；（b）氢营养型产甲烷菌。误差条表示SD。

       图10示出，随着ETC值的增加，主要的乙酰营养和氢化产甲烷菌的相对丰度分别降低和增加，表明污泥的电子转移电位可能与两种产甲烷菌的种群有关。相关分析证实了这种可能性如图10（a）所示，ETC值与主要产乙酰营养型产甲烷菌的相对丰度呈显著负相关（R>0.69，P<0.01），而ETC值与主要氢营养型产甲烷菌的相对丰度呈显著正相关（R>0.77，P<0.01）（图10（b））。电子转移电位的提高似乎有利于主要氢营养型产甲烷菌的富集，但不利于主要乙酰营养型产甲烷菌的富集。在氢营养型产甲烷菌所使用的代谢途径中，CO₂还原为CH₄可能严重依赖于电子，因此高电子转移电位有利于CO₂的还原。相反，在乙酰营养型产甲烷菌所使用的代谢途径中，甲基作为一个单元从乙酸转移到CH₄，并且每个CH₄分子的一个H原子来自溶剂（即H₂O）。因此，乙酰营养型产甲烷菌将醋酸盐分解成CH₄和CO₂的过程可能不太依赖于电子供应。因此，在整个产甲烷发酵过程中，较高的电子转移电位有助于氢营养型产甲烷菌的富集，使其比主要的乙酰营养型产甲烷菌更具优势。这一结果还表明，pI预处理可以通过提高污泥的电子转移电位来提高氢营养型产甲烷菌的相对丰度。

       然而，我们注意到，微生物表面热力学是连接微观尺度生物结构和宏观尺度生物功能的典型桥梁。由于WAS主要由微生物组成，因此其固液界面热力学将架起污泥微观结构与产甲烷发酵等宏观生物功能之间的桥梁。pI预处理通过部分去除多价金属来破坏污泥结构，显著改变污泥的固液界面热力学，从而影响宏观生物功能，导致微生物多样性的变化。具体而言，pI预处理显著提高了污泥的自驱动固液界面疏水相互作用（图3）和电子转移效率（图4），从而增加了主要乙酰营养型和氢营养型产甲烷菌的相对丰度（图5）。电子转移电位对氢营养型产甲烷菌的促进作用比对乙酰营养型产甲烷菌的促进作用更强，这导致前者的相对丰度更大的增强和产甲烷菌群落结构的变化（图6和8）。

       在本研究中，我们证实了pI预处理可以增强污泥的自驱动固液界面非共价相互作用，提高污泥的电子传递效率，从而增强驱动酶间反应的非生物力，提高污泥中功能微生物的相对丰度水解、酸化和甲烷化。这些变化提高了WAS中甲烷的生成效率。主要结论如下：

    （1） pI预处理提高了WAS产甲烷潜力、产甲烷速率和沼气中甲烷的比例。例如，pI预处理后，最大产甲烷潜力和产甲烷率分别提高了122.2%和154.4%，沼气中甲烷的最大比例达到76.8%。

    （2） pI预处理增强了污泥自驱动的固液界面疏水相互作用，通过增强产甲烷发酵过程中的疏水吸引力，增强了污泥界面酶促反应的驱动力。

    （3）pI预处理通过正向移动产甲烷发酵过程中的还原峰电位，提高了污泥的电子转移效率并减少了还原反应的障碍。

    （4） pI预处理提高了水解、酸化和甲烷化主要功能微生物的相对丰度，尤其是氢营养型产甲烷菌（+29.9%）。

    （5）污泥产甲烷发酵能力与固液界面非共价相互作用之间存在着密切的内在联系。污泥表面具有较强的疏水吸引力和较高的ETC能提高甲烷的生成效率。

这些发现将为开发第二代预处理方法提供参考，其目的是通过去除污泥中固有的抑制物质和增加驱动污泥中表面酶反应的非生物力来提高污泥的生物降解性，而不是仅仅关注初始有机物污泥溶解。此外，这些发现还为通过监测界面热力学、电化学特性和微生物群落的变化，为揭示厌氧发酵这一“黑箱”过程提供了理论技术参考。

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