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T6SS主要调节机制与研究方向

T6SS效应蛋白介绍

T4SS生物学功能与研究技术

T4SS生物学功能以及研究方法

T4SS的底物类型及转移方式

T6SS组分调节机制

T6SS基因簇的表达受各种环境线索调控，许多生物体甚至具有多个具有不同功能的独立调节的T6SS。然而，从结构的角度来看，有趣的是T6SS组装在一些生物体中也在翻译后受到调节。例如，在铜绿假单胞菌（H1-T6SS）的三个T6SS簇中的第一个中，辅助蛋白TagH被同源的丝氨酸-苏氨酸激酶（serine–threonine kinase）PpkA磷酸化，并被磷酸酶PppA去磷酸化。TagH在S. marcescens中也被磷酸化，但在根癌土壤杆菌中，T6SS组装受TssL的磷酸化调节。在铜绿假单胞菌的H1-T6SS中，PpkA活化需要周质蛋白TagR，其通过与TagQ的相互作用锚定在外膜上。另外，显示TagT和TAG形成具有ATP酶活性的内膜复合物并作用于PpkA的上游。有趣的是，在铜绿假单胞菌中，H1-T6SS也可以通过失活另一种辅助蛋白TagF而独立于TagH磷酸化而被激活。

T6SS 可受环境因素调节，副溶血性弧菌中，高盐及较高的温度条件可通过激活 TfoY 和 T6SS1 调节子 vp1391 和 vp1407，从而促进 T6SS1 的分泌及表达，低盐及低温条件下可以促进 T6SS2 分泌。霍乱弧菌中 T6SS 受渗透压调节，渗透压降低时，T6SS 相关基因表达被抑制；渗透压升高时，抑制作用解除。

金属离子吸收对ROS胁迫反应的影响

宿主免疫和环境因素如重金属和抗生素都会导致细菌病原体中活性氧（reactive oxygen species , ROS）水平显著增加。ROS（e.g., hydrogen peroxide, hydroxyl radical, and superoxide，例如过氧化氢，羟基自由基和超氧化物）的形成在富氧环境中是不可避免的。导致ROS产生的其他因素包括肽聚糖识别蛋白，具有杀菌活性的抗微生物化合物，以及来自竞争细菌和噬菌体的攻击。细胞中ROS水平升高将对DNA，蛋白质，脂质和其他大分子造成氧化损伤。众所周知，细菌在一些调节蛋白的帮助下对氧化应激作出反应，如协调特定ROS应激耐受机制的SoxR，SoxS，OxyR或ZntR。例如，可以通过这些调节蛋白诱导抗氧化酶（e.g., peroxidase, glutaredoxin, uperoxide dismutase, thioredoxin，例如过氧化物酶、谷氧还蛋白、超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白）和小分子量抗氧化剂（e.g., β-carotene, tripeptide glutathione, vitamin C, and vitamin E，例如β-胡萝卜素、三肽谷胱甘肽、维生素C和维生素E）的合成，以对抗ROS的不利影响。

近年来，已经发现T6SS参与细菌病原体的氧化应激反应过程，例如（Vibrio anguillarum, Burkholderia thailandensis , Enterohemorrhagic E. coli , and Yersinia pseudotuberculosis）鳗弧菌，泰国伯克霍尔德氏菌，肠出血性大肠杆菌和假结核耶尔森氏菌。金属离子如锌（Zn2+）和锰（Mn2+）可用作抗氧化酶的结构组分或辅因子。这些金属离子也参与抗氧化剂络合物的形成。这两种金属都有助于细菌维持氧化还原平衡并消除ROS。锌（Zn2+）是参与维持细菌氧化还原稳态的几种机制的必需营养素，例如作为超氧化物歧化酶的辅因子。

例子：

1. 在氧化应激的条件下，B.thailandensis（泰国伯克霍尔德氏菌）利用T6SS将TseZ作为Zn2+结合效应物输出。在外源性氧化胁迫下，通过导入锌离子，提高存活率，降低ROS水平。该组证明T6SS效应子TseZ与HmuR (the outer membrane heme transporter，外膜血红素转运蛋白）相互作用，并进一步表明HmuRSTUV系统参与氧化应激条件下Zn2+的获取。HmuR是一种受氧化还原调节的双功能转运蛋白。HmuR在正常条件下运输血红素铁，并在检测到氧化应激后形成分子内二硫键。二硫键的形成导致构象变化，其允许HmuR结合TseZ，并且更有效地将螯合的Zn 2+转移到细胞中。这是一个微调的机制，允许B.thailandensis响应不同水平的氧化应激。

2. 在Y.pseudotuberculosis（假结核耶尔森菌）中，MarR家族转录调节因子HpaR直接结合T6SS的启动子以上调其表达。T6SS可以分泌YezP（锌结合蛋白底物），其结合细胞外Zn2+并将其转运到Y.pseudotuberculosis中。

锰（Mn2+）是另一种重要的微量元素过渡金属，参与许多生化过程，特别是抵抗氧化应激的过程。在某些含铁酶中，Mn2+可以作为辅助因子或铁的替代物，减少ROS对细菌的伤害。在哺乳动物宿主体内，Mn2+受到营养免疫机制的严格限制。细菌也有几种获取锰的策略，包括ATP结合盒家族转运体、Mn2+选择性通道蛋白和天然抗性相关巨噬细胞蛋白家族转运体（ATP-binding cassette family transporter , Mn2+-selective channel protein , and natural resistance-associated macrophage protein family transporter .）。在氧化应激条件下，泰国双歧杆菌T6SS分泌TseM（Mn2+结合效应子），其结合Mn2+以通过MnoT（一种依赖于TonB的外膜转运体）促进其摄取。

适应温度和pH的变化

低pH值是宿主感染时防御机制产生的一个因素，可以限制病原体的生长。T6SS还在对细胞内低pH的细菌应激反应中起作用，细胞内低pH是细菌在吞噬过程中经常遇到的环境压力。OmpR是来自EnvZ/OmpR双组分调节系统的充分表征的调节剂，其调节基因的表达以响应渗透压和pH的变化。Y.pseudotuberculosis（假结核耶尔森菌） OmpR直接与T6SS的启动子结合以调节其表达，在Y.pseudotuberculosis中，ClpV4可能利用其ATPase活性将氢离子泵入细胞外基质以维持细胞内pH稳态。这可能是病原体抵抗吞噬体中遇到的酸性环境的一般策略。在根癌土壤杆菌中，ExoR-ChvG/ChvI级联可以在酸性条件下激活T6SS。ExoR在中性pH环境中与ChvG（transmembrane sensor kinase，跨膜传感器激酶）结合，其通过物理相互作用抑制ChvG/ChvI双组分系统信号传导，导致T6SS表达和分泌活性降低。在酸性pH下，ExoR不再抑制ChvG的活性，其使响应调节剂ChvI磷酸化并因此正调节T6SS的表达。在α-变形杆菌（包括许多共生体和植物或动物病原体）中，由于ExoR和ChvG/ChvI在这些细菌中的广泛分布和高度保守性质，ExoR-ChvG/ChvI级联系统调节T6SS可能是常见现象。

细菌病原体可以使用T6SS来促进适应温度变化。例如，温度是调节霍乱弧菌生理的重要环境信号，对其生存状态和致病性有很大影响。霍乱弧菌冷休克蛋白CspV显示出在温度变化时调节T6SS并介导种间杀伤。在水生甲壳类动物大型蚤感染模型中，CspV缺陷型霍乱弧菌菌株显示出由T6SS介导的显着降低的毒力。霍乱弧菌T6SS相关基因如编码溶血素共调节蛋白的hcp的表达在15℃下调并在25℃上调。

种间和种内竞争

细菌可以感知来自邻近细胞T6SS的攻击并激活它们自己对它们的应激反应。最充分表征的实例之一是铜绿假单胞菌在被来自霍乱弧菌的TseL（具有磷脂酶活性的T6SS效应子）攻击后迅速激活其自身的T6SS以对抗霍乱弧菌。Kamal及其同事提出，TseL可以激活铜绿假单胞菌T6SS的表达和组装，引起对霍乱弧菌的报复性反应。在来自邻近细胞的T6SS攻击下，铜绿假单胞菌激活其免疫非依赖性应激反应途径以进行自我保护。另一方面，TagQRST-PpkA-PppA-Fha1的调节级联可以感知来自霍乱弧菌T6SS的攻击。TseL可以被TagQRST感知，其反过来诱导铜绿假单胞菌对霍乱弧菌的报复。铜绿假单胞菌的应激反应系统协调对霍乱弧菌效应物的强烈防御，并有助于其在细菌竞争期间的存活。这种新型的免疫非依赖性应激反应类似于细菌的先天免疫。

由于许多T6SS系统攻击细菌细胞壁，细菌经常会诱发包膜应激反应(envelope stress response)以抵御这些攻击；包膜应激反应保持膜的完整性，以抵抗效应器引起的损伤。霍乱弧菌TseH是一种PAAR依赖性物种特异性杀伤性T6SS效应子，显示可破坏细胞壁并激活大肠杆菌的两个包膜应激反应途径Rcs磷酸化和BaeSR双组分系统.Rcs通过激活渗透反应基因的表达和增加胞外多糖（exopolysaccharides , EPS）的产生来帮助大肠杆菌抵抗TseH介导的攻击。此外，Rcs诱导胶囊合成(capsule synthesis) 和粘液集落(mucoid colonies)的形成，其中荚膜酸胶囊显着增加大肠杆菌对T6SS攻击的抗性。霍乱弧菌采用双组分系统WigKR（VxrAB）来响应细胞壁损伤并诱导肽聚糖修复基因的表达以保护自身免受自杀，作为一种免疫非依赖性基因防御。野生型霍乱弧菌菌株可通过递送TseH有效杀死wigKR突变体。WigKR积极调节生物膜的形成和弧菌多糖（VPS）的合成。

应激反应也参与由T6SS介导的物种内竞争。具有相同T6SS效应模块的霍乱弧菌菌株可以共存和兼容，而缺乏同源免疫基因的菌株是不相容的并且竞争激烈。产毒霍乱弧菌菌株携带AAA效应/免疫模块( AAA effector/immunity module )，其提供最有效杀死非亲缘霍乱弧菌菌株。效应模块是霍乱弧菌由于 T6SS 基因簇遗传多样性而具有差异的部分，通过 GC 组分的含量差异而相互区分。效应模块的存在为每个霍乱弧菌菌株提供了相应的特性。具有相同效应模块的霍乱弧菌可以共同存活，而当效应模块不同时，T6SS 将被激活，并且竞争性的杀灭其他菌株.

T6SS参与宿主免疫信号通路的调控

炎性体激活（Inflammasome activation）是先天免疫反应的关键防御机制，宿主利用它来对抗入侵细菌。宿主可以通过在炎性体激活期间释放促炎细胞因子来触发细胞焦亡pyroptosis。炎性细胞质内容物在骨髓细胞发生pyroptosis后释放到细胞外环境中，进一步激活先天免疫反应并加速体内细菌的清除。 迟缓爱德华氏菌 Edwardsiella tarda可通过T6SS显著抑制NLRP3炎症小体的形成。EvpP（Edwardsiella tarda的T6SS效应子）能抑制Ca2+-dependent c-Jun N-terminal kinase 钙依赖性c-Jun N末端激酶（Jnk，一种应激反应性MAPK信号通路）的激活，导致ASC寡聚化失败，最终抑制NLRP3炎症体的激活。EvpP介导的NLRP3炎性体的抑制，促进了体内细菌定植。这是病原菌用于阻断宿主信号转导并逃避宿主先天免疫应答的机制。

肠炎沙门氏菌的溶血素共调节蛋白（Hcp）是形成内管的T6SS的结构组分，其对于效应蛋白的分泌和T6SS装置的组装是关键的。通过在BHK-21细胞中表达携带pEGFP-N1-Hcp的质粒发现Hcp在细胞质中的亚细胞定位，其中Hcp调节沿着TNF信号传导途径的基因表达。

群体感应QS调节

1、Vibrio sp. (弧菌属)

霍乱弧菌 T6SS 主要有两种参与细菌致病性的方式，即直接转移效应因子和破坏宿主巨噬细胞的吞噬功能。同时，霍乱弧菌的 T6SS 可以相互识别并介导霍乱弧菌之间的相互竞争性攻击。

两种QS自诱导剂CAI-1（cholerae autoinducer）和AI-2（autoinducer-2）根据细胞密度控制基因表达而进行协同作用。这些自诱导剂的生物合成需要两种酶：CqsA和LuxS。这些信号分子由两种传感器激酶检测，LuxQ（CAI-I传感器）和CqsS（AI-2传感器）。这两种途径都与磷酸转运蛋白LuxU结合。在低细胞密度（LCD）下，由于缺乏各自的自诱导剂，组氨酸激酶 CqsS，LuxQ，VpsS和CqsR磷酸化LuxU。然后，LuxU将磷酸化基团转移到LuxO（DNA结合应答调节蛋白）上。当细胞密度低时，与sigma因子σ54相互作用，磷酸化LuxO激活sRNA分子（称为qrr1-4）的表达，与RNA结合蛋白Hfq一起，LuxO抑制HapR的表达，HapR是一种作用于QstR的TetR家族全局转录调节因子。当细胞密度高时，HapR积累，因为LuxO未被磷酸化并且sRNA的转录被阻断。QstR是T6SS的主调节器，属于LuxR型调节器家族。QstR结合T6SS簇的启动子区域，诱导基因的表达。通过cAMP-CRP途径调节T6SS尚不清楚，但它可能通过调节QS和几丁质诱导的能力来影响T6SS基因。已知CRP正调节T6SS。除了通过QS激活QstR外，它还受几丁质和阿拉伯糖的调节。霍乱弧菌中三个T6SS基因簇的表达需要TfoX，CytR，HapR和QstR以获得最高水平的表达。CytR和TfoX是T6SS基因表达所必需的，但它们的调节作用是仅由QstR介导。）

在溶藻弧菌中，已发现T6SS和QS网络的活化由丝氨酸/苏氨酸激酶PpkA级联协调。PpkA2是自磷酸化的，它将磷酸基团转移到VstR。磷酸化的VstR通过抑制LuxO活性促进溶藻弧菌中两种T6SS的表达，LuxO活性阻止T6SS启动子LuxR的表达。

LuxR抑制第一个T6SS（T6SS1）的表达或促进第二个T6SS（T6SS2）的表达。在低细胞群密度下，LuxO被磷酸化，其与sigma factor σ54一起激活特定的small regulatory RNAs （sRNA）的表达。sRNA在RNA伴侣Hfq蛋白的帮助下抑制LuxR的表达。

然而，在高细胞群密度下，LuxO被去磷酸化，关闭sRNA的转录并允许LuxR的翻译。hcp T6SS基因的表达是生长期依赖性的，并且QS调节因子控制溶血素共调节蛋白（ haemolysin co-regulated protein），其是T6SS的主要蛋白之一，其作为系统的效应子和/或效应子结合蛋白。

磷酸酶PppA还作用于QS（调节LuxR的转录）以及hcp1和hcp2的表达和分泌。重要的是要强调PppA允许溶藻弧菌中两个T6SS之间的相互作用，Rpo-N（σ54）与QS在T6SS基因的调控中起协同作用。它参与调控编码T6SS分泌分子的hcp和vgrG3操纵子的表达，但不控制编码T6SS结构和鞘成分的基因。

2、Pseudomonas aeruginosa （铜绿假单胞菌）

铜绿假单胞菌 T6SS / IAHP ( IcmF-associated homologous proteins，IAHP) 核心基因簇为 Hcp1 分泌岛 I( Hcp1 secretion islandI，HSI-I) ，与霍乱弧菌的 vas 基因簇相对应，是编码 T6SS 的核心基因簇。铜绿假单胞菌 T6SS 由 HSI-I 基因簇编码，并主要分泌 Hcp 蛋白以及一些如 Tse1、Tse2和 Tse3 的效应因子。由于缺乏具有功能的VgrG 蛋白，铜绿假单胞菌 T6SS 的致病机制，主要为细胞外膜受到扰动后激活 T6SS，直接分泌效应蛋白进入宿主细胞内进行杀伤的单一方式。因其独特的传感激活方式，铜绿假单胞菌 T6SS 在其与其他同种或异种细菌的竞争过程中发挥重要作用，在多种细菌复合感染致病的过程中具有重要意义。铜绿假单胞菌 T6SS 可以介导铜绿假单胞菌对外源基因的免疫作用。由于外源性基因多数都会对铜绿假单胞菌造成损害，因此，铜绿假单胞菌会排斥外源基因，而其 T6SS 即发挥此种功能，被视为铜绿假单胞菌的免疫系统

T6SS参与铁运输，T6SS与QS之间通过TseF蛋白建立联系，TseF蛋白是T6SS的底物并与假单胞菌喹诺酮信号 (PQS, Pseudomonas quinolone signal)相互作用。在铜绿假单胞菌中，已发现编码T6SS的三个基因座受QS蛋白（LasR和MvfR）调节。第二个基因座H2-T6SS的表达受PAO1菌株中的Las和Rhl QS系统以及PA14中MvfR的直接结合的调节。

3、Other Pathogens

据报道，群体感应控制Burkholderia thailandensis（泰国伯克霍尔德菌）中T6SS毒素免疫系统的表达。此外，在B.thailandensis中已经描述了T6SS在限制了QS突变体增殖。有趣的是，在缺乏AHL-QS途径的Pseudomonas fluorescens (荧光假单胞菌) MFE01菌株中，已经观察到T6SS效应器作为细胞间信号发挥作用。在嗜水气单胞菌中（ A. hydrophila），Hcp和VgrG这两个“核心”蛋白和T6SS分泌的效应因子被认为受AhyRI QS调控。

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