革兰氏阴性菌的耐药性是困扰世界各国的一大难题，常导致常用的抗生素失去杀菌作用，为临床上抗感染的治疗带来了严峻挑战。RND (Resistance-nodulation-cell division)家族外排泵能够有效地外排多种抗生素，是许多临床相关的革兰氏阴性菌多重耐药的主要决定因素。这类外排泵横跨细菌内外膜和膜间质地，由外膜通道蛋白、膜间质蛋白和内膜外排转运蛋白三部分组成。AcrAB-TolC是RND家族中最著名的外排泵复合物，由外膜通道蛋白TolC、膜间质蛋白AcrA和内膜转运蛋白AcrB组成。

在2019年，王钊团队首次报道了大肠杆菌多药外排泵AcrAB-TolC的原位结构，揭示了其在细胞内的组装机制。然而，当时解析出来的原位结构分辨率只有15 Å，其提供的结构信息不足以理解原生细胞环境对AcrAB-TolC各组分及其变构方式的影响。经过一年多的努力，王钊团队通过优化制样方法、改进数据收集方式，以及使用新开发的的EMAN2软件，最终成功解析出7Å分辨率的AcrAB-TolC外排泵原位结构（见图1）。

图1. AcrAB-TolC多药外排泵亚纳米分辨率的原位结构

在亚纳米分辨率之下，TolC通道的下部分以及AcrA的上部分都可以看到许多α螺旋，体外的高分辨结构可以做到很好地拟合。和冷冻电镜单颗粒方法等体外结构生物学方法获得的结构不同的是AcrA的近膜结构域，可能是由于在体内存在和膜的相互作用，整体发生了逆时针方向8°的旋转（从胞外向胞内观察）。从密度图上来看，外膜的外层明显厚于内层，表明外膜的外面存在多糖层，而TolC穿越了外膜以及外膜外侧的脂多糖。由于TolC、AcrA、AcrB在复合物中的比例为3:6:3，理论上TolC三聚体相对于AcrB三聚体会存在两种可能的转向，即TolC三聚体有一个60度的旋转。在高分辨原位结构中，确实观察到这两种复合物的存在，不过二者所占比例大概持平。值得一提的是，从AcrAB-TolC亚纳米分辨率的原位结构中观察到了AcrA的末端，该部分结构在以往发表的AcrAB-TolC结构中都是不可见的。

更为有趣的是，在AcrAB-TolC亚纳米分辨率的原位结构里，AcrA的末端明显地打破了六重对称性。六个AcrA的末端无论是只和AcrB相互作用，还是和AcrB以及内膜均相互作用，都表现两种不同的构象。此外， AcrA展现出和AcrB更为广泛的相互作用，尤其是AcrA 原体II末端区域和AcrB的PC2亚区相互作用。PC2亚区在AcrB从结合态到挤压态，以及从挤压态到进入态的转换中均经历了很大的构象改变。于是王钊团队提出了AcrAB-TolC外排泵通过构象改变进行药物外排的机制（图2）：AcrA的原体 II末端和AcrB的porter domain的PC2亚区的相互作用，以及AcrA原体I 和内膜的相互作用可能一起起始了AcrB从结合态到挤出态，从挤出态到进入态转变过程中构象变化的传递。

图2. 在药物传输中AcrA将构象改变的信号从AcrB传递到TolC的模型

本研究提示，AcrA可以作为传递蛋白构象改变的通路，将AcrB结合和运输底物时产生的构象改变传递到TolC，影响TolC通道的开关。本研究展示了原位cryo-ET是揭示细菌多药外排泵的结构与功能的重要技术手段。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.str.2021.08.008