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论文赏析:甲状腺肿瘤PTEN基因甲基化与PI3K/AKT信号通路基因变异的关系研究

已有 997 次阅读 2020-11-2 14:32 |个人分类:甲状腺癌|系统分类:论文交流

文献来源:Association of PTEN Gene Methylation With Genetic Alterations in the Phosphatidylinositol 3-Kinase/AKT Signaling Pathway in Thyroid Tumors,Cancer 2008;113:2440–7. (影响因子6.1)

本研究包括两个部分,第一个部分是基于肿瘤组织样本的试验(收集3种不同阶段组织样本,共143例),主要考察1)甲基化水平与肿瘤进程的关系;2)信号通路中基因变化与甲基化的关系。第二部分是基于培养细胞系的试验,考察信号途径抑制剂对PTEN基因蛋白及RNA表达水平的影响。

1、背景

在甲状腺肿瘤发生和发展过程中PI3K/AKT信号通路发挥着重要作用。该通路因基因改变(特别是PIK3CA基因和Ras基因的改变)而异常激活是甲状腺肿瘤发生的主要原因。另一方面,甲状腺肿瘤的PTEN基因因甲基化而沉默,导致PI3K/AKT通路下调,但PTEN基因与该信号通路的基因改变有何关系仍不清楚。

2、材料与方法

2.1甲状腺细胞系

本研究使用了5种人甲状腺癌细胞系:ATC细胞系Hth7、Hth74和SW1736细胞系最初来自N.E.Heldin博士(瑞典乌普萨拉大学);ATC细胞系KAT18来自肯尼思.艾因博士(肯塔基大学医学中心,莱克星顿);FTC细胞系FTC133来自Georg Brabant博士(曼彻斯特大学,英国,曼彻斯特)。这些细胞系用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在370C下进行培养。在一些实验中,采用AKT抑制剂IV(EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ)处理细胞。

2.2甲状腺肿瘤DNA

甲状腺肿瘤DNA样本来源于先前的研究,其制备方法如前所述。本研究共分析143例甲状腺肿瘤,包括42个BTA、65个FTC和36个ATC。

2.3亚硫酸氢钠处理

如前所述,从肿瘤组织提取DNA,并用亚硫酸氢钠进行处理。简单地说,取2mg基因组DNA、10 mg鲑鱼精子DNA和0.3 M NaOH,加蒸馏水至最终体积23 mL,在500C下20分钟使DNA变性。随后,将以上混合液放入新制备的500 mL溶液(含3 M亚硫酸氢钠和10 M M对苯二酚的溶液)中在700C下恒温处理3小时。处理后,用Wizard DNA纯化系统(Promega公司,麦迪逊,威斯康星州)对DNA进行纯化,然后经过乙醇沉淀,真空干燥,DNA溶解在30毫升的水中。亚硫酸氢钠处理后,所有未甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶,甲基化残基保持不变。DNA样本经亚硫酸氢钠修饰后在280C温度下保存。

2.4甲基化特异性实时定量PCR分析(QMSP)

实时定量甲基化特异性聚合酶链反应分析(QMSP)如前所述,每一个DNA样品的反应一式三份,总体积为20mL,含有亚硫酸氢钠处理后的基因组DNA3mL,每种引物600 nM,探针200 nM,MgCl25.5 mM,钯Taq聚合酶5U,脱氧核苷三磷酸(A,C,G,T)每种各200mM以及2% Rox内参。使用ABI Prism 7900HT 扩增仪(加州福斯特市PerkinElmer)在950C下初始变性2分钟后,在950C下15秒,600C下15秒运行45个循环以便退火和延伸。正常白细胞DNA用甲基化酶SssⅠ进行甲基化处理(新英格兰生物实验室,贝弗利,马萨诸塞州)以产生完全甲基化的DNA作为阳性对照。每个板含有三份样品和多个空白水,以及阴性未甲基化对照品和阳性甲基化对照品的连续稀释液,以构建校准曲线。用于PTEN基因的引物和探针如前所述,分别是50-GTT TCG cgtt TGT TGTAAA AGT CG-30(sense);50-CAA TAT AAC ctaaa CTT ACT CGA ACC-30(反义);50-6famttcca ACC GCC AAC CTA CAC TTATAMRA-30(探针)。RASSF1A基因的引物和探针如前所述,为50-GCG TTG AAG TCG GGG TTC-30(sense);50-CCC GTA CTT CGC TAA CTT TAA ACG-30(反义);50-6FAM-ACA AAC GCG AAC CGA ACGAAA CCA-TAMRA-30(probe)。内参照基因β-actin的引物和探针分别为50-TGGTGA-TGG-AGG-AGG-T T T-AGT-AAG-T-30(sense)、50-AAC-CAA-TAA-AAC-CTC-CCT-TAA-30(反义)和50-6FAM-ACC-ACC-ACC-CAA-ACA-AAC-ACA-TAMRA-30(probe)。用前面描述的方法计算每个DNA样本的相对甲基化水平。

2.5 分析PI3K/AKT途径中的遗传改变

PI3K/AKT途径相关的遗传改变包括PIK3CA拷贝数扩增、PIK3CA突变(第9和20外显子)、Ras突变(N2-ras、H2-ras,K1 ras)和PTEN突变(第5、6、7和8外显子)。分析方法如前所述(Hou P, Liu D, Shan Y, et al. Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in thyroid cancer. Clin Cancer Res. 2007;13:1161-1170.)

Western印迹分析

为了证实AKT抑制剂对细胞PI3K/AKT信号的抑制作用,我们进行了AKT磷酸化水平的Western blotting分析。在RIPA缓冲液中进行细胞裂解(加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司)。裂解物在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(10%)凝胶上电泳,然后将电泳产物转膜到聚偏二氟乙烯膜(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)上,并用特异性一级抗体(抗磷酸AKT(Sc-7985-R)、抗AKT-1/2/3(Sc-8312)和抗肌动蛋白(Sc-1616-R))进行免疫印迹反应(圣克鲁斯生物技术公司)。抗原抗体复合物采用辣根过氧化物酶-结合抗鼠(SC-2005)或抗兔(SC-2004)免疫球蛋白G抗体(圣克鲁斯生物技术)和ECL Western印迹分析系统(Amersham Pharmacia)观察。

统计分析

样本平均数的比较采取方差不等的成组t检验进行。少于4例的数据采取双尾Fisher exact检验进行。

3、技术路线

3.1材料

5种培养细胞系(BTA\ATC\FTC代表肿瘤不同阶段)

3种甲状腺肿瘤组织样本DNA (BTA\ATC\FTC代表肿瘤不同阶段)

3.2 AKT抑制剂IV

3.3 检测指标

l  PTEN/RASSF1A(甲基化水平、蛋白质表达水平)

l  PI3K/AKT通路有无基因改变(+/-)

4、结果

从良性甲状腺腺瘤(BTA)到滤泡性甲状腺癌(FTC),再到侵袭间变性甲状腺癌(ATC),PTEN甲基化水平逐渐升高。另一方面,随着PI3K/AKT信号通路中的基因改变被激活,肿瘤患病率逐渐升高。PTEN基因的甲基化与整体基因改变和个体基因变异均有关系,特别是PIK3CA和Ras基因变异,PI3K/AKT通路在3种甲状腺肿瘤中的表达。相反,肿瘤抑制基因RASSF1A没有这种关系。

结论

在甲状腺肿瘤中,PTEN甲基化与PI3K/AKT通路的基因改变存在着有趣的关联性。与此相适应的模型是:PTEN基因因异常甲基化而沉默,激活了PI3K/AKT通路的基因改变,该通路的信号增强而导致甲状腺肿瘤恶化。

结果与分析

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图1. 三种甲状腺肿瘤的甲基化水平(检测方法:甲基化特异性定量PCR检测)

Y轴是相对甲基化水平,计算公式分别为:PTEN/β-actin×1000(A)和 RASSF1A/β-actin×100(B)。图中三组甲状腺组织样本分别是良性甲状腺腺瘤(BTA,42个样本),滤泡性甲状腺癌(FTC,65例)和间变性甲状腺癌(ATC,36例)。红色横杠表示每组的平均值。**表示差异极显著(P<0.01)。

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图2. PTEN(A)与RASSF1A(B)高甲基化与PI3K/AKT途径遗传改变的关系

PI3K/AKT途径中的遗传改变与PTEN (A) 和 RASSF1A (B)两个基因发生高甲基化的关系。纵坐标表示两个基因的甲基化水平。-号表示在PI3K/AKT途径中缺乏遗传改变;+号表示在PI3K/AKT途径中存在遗传改变。ATC=间变性甲状腺癌;BTA=良性甲状腺腺瘤;FTC=滤泡状甲状腺癌症。红色横条表示每组的平均值。*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

表1

PTEN高甲基化与甲状腺肿瘤PI3K/AKT途径遗传总变化的关系

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BTA表示良性甲状腺腺瘤;FTC,滤泡性甲状腺癌;ATC,间变性甲状腺癌症

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图3. 每个甲状腺肿瘤病例中PI3K/AKT路径相关基因改变的分布

Y轴代表PTEN基因的甲基化水平,如图1所示。每个圆圈对应于一个甲状腺肿瘤病例。实心圆代表PI3K/AKT通路上有遗传改变的病例,空心圆代表没有遗传改变的病例。虚线表示甲基化水平为10。ATC 代表间变性甲状腺癌;BTA代表良性甲状腺腺瘤;FTC代表滤泡状甲状腺癌症。

表2

甲状腺肿瘤中PTEN高甲基化与PIK3CA改变(扩增和突变)或Ras突变的关系

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BTA=良性甲状腺腺瘤;FTC=滤泡性甲状腺癌;ATC=间变性甲状腺癌。image.png

图4. PTEN甲基化与遗传改变的关系

图4显示PTEN甲基化与甲状腺肿瘤PI3K/AKT通路中单个基因的遗传改变的关系。纵轴表示相对甲基化水平。良性甲状腺腺瘤(BTA)(A)和滤泡甲状腺癌(FTC)(B)。主要的遗传改变包括PIK3CA扩增和突变(称为“PIK3CA改变”)和Ras突变。对于间变性甲状腺癌(ATC)(C),PIK3CA改变是主要的遗传因素事件。红色短横线表示平均值。虚线表示甲基化水平为10。N代表无遗传改变;P代表PIK3CA改变;R代表Ras突变。与没有遗传改变的组相比,*表示差异显著(P<0.05);**代表差异极显著(P<0.01)。

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图5. 甲状腺癌细胞中 PI3K/AKT途径的抑制作用对PTEN基因甲基化状态的影响

(A)Western blotting分析:5种甲状腺癌细胞系分别用AKT抑制剂(每日2 mM)处理4天,以不处理的为对照,测定PI3K/AKT信号途径的信号。方法是用总AKT(t-AKT)和β-actin作为蛋白质定量对照,用磷酸化AKT(p-AKT)特异性抗体进行杂交。

(B)甲基化特异性PCR:从细胞中提取基因组DNA,经过亚硫酸盐处理后用于PTEN基因甲基化分析。*表示差异显著(P<0.05)。

Hou P, Liu D, Shan Y, et al. Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in thyroid cancer. Clin Cancer Res. 2007;13:1161-1170.




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