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论文赏析:用粪便样本进行SDC2甲基化特异性的定量检测可以探测早期肠癌

已有 798 次阅读 2020-10-31 16:26 |个人分类:结直肠癌|系统分类:论文交流

 

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文献来源:Clinical epigenetics 9,2


摘要

背景:本研究的目的是评估大肠癌各期肿瘤组织中SDC2甲基化的频率,并探讨用实时定量 PCR检测粪便DNA中SDC2甲基化的可行性。

方法:组织样品采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序法测定SDC2甲基化状态。粪便样本采用LTE-qMSP分析方法进行SDC2甲基化分析。LTE-qMSP分析方法由连续两轮的PCR分析组成,包括SDC2的单向线性目标富集(LTE)和SDC2的甲基化特异性定量实时PCR(qMSP)。其检测限为0.1%甲基化(相当于从6200个基因组拷贝中检测出6个拷贝)。

技术路线

培养细胞株、临床组织样本——SDC2甲基化测序——甲基化指数(MtI)

粪便样本——LTE-qMSP——两轮PCR扩增——Ct值

实验设计:

样本类型

组织样本

粪便样本

正常人

n=5

n= 22

息肉(下分4类)

n=49

n=21

癌症(下分4级)

n=18

n=50

合计

n=72

n=93

结果:甲基化水平检测结果显示,原发性肿瘤100%,腺瘤性息肉90.6%,增生性息肉94.1%,正常组织0%。SDC2甲基化水平随着病变的加重而显著升高(P<0.01)。LTE-qMSP粪便DNA检测SDC2甲基化,将不同分期(I~IV)的CRC患者(n=50)和癌前病变(n=21)与健康人(n=22)比较,CRC和小息肉的总灵敏度分别为90.0%和33.3%,特异性为90.9%。

结论:作为一种基于粪便DNA的SDC2甲基化检测方法,LTE-qMSP可用于结直肠癌的无创性诊断工具和早期检测。


引言

本研究的目的是试图用实时荧光定量 PCR方法检测粪便DNA中SDC2甲基化状态来评估患者患结直肠癌的风险。


材料与方法

1、试剂

化学试剂引物和荧光探针。


2、细胞株

细胞株:人结肠癌细胞HCT116、SW480和HT-29。

培养基: RPMI 1640培养基,添加10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。

培养条件:37°C、5% CO2,加湿培养箱中培养。

 

3、临床标本

3.1息肉组织石蜡切片(n=49)

3.2新鲜原发性大肠肿瘤组织冰冻切片(n=18)。

用标准切片机切割组织块以产生连续切片。它们被安装在粘有硅烷涂层的载玻片上。通过苏木精和伊红染色标记和鉴别息肉和肿瘤,然后供外科病理专家进一步开展DNA研究。

3.3正常人粘膜基因组DNA(n=5)。

3.4粪便样本:病理学确诊的结直肠癌(n=50)、腺瘤性息肉(n=21)和正常健康人(n=22)。

 

4、DNA提取

4.1组织和细胞系:基因组DNA用QiaAmp DNA迷你试剂盒提取。

4.2粪便样本:使用QIAamp 粪便DNA迷你试剂盒提取。

 

5、亚硫酸氢盐处理

5.1亚硫酸氢钠处理:在65℃下处理基因组DNA 2.5h。

5.2脱硫:在室温下脱硫20 min。

5.3过柱纯化:亚硫酸氢钠转化的DNA用Zymo-Spin IC柱纯化。

5.4洗脱:用10μL蒸馏水洗脱。洗脱后的DNA立即用于甲基化分析,或在-20°C下储存。

 

6、亚硫酸氢盐焦磷酸测序法测定组织中SDC2基因甲基化

6.1引物设计:利用热标记分析设计软件v.2.0对SDC2基因5′调控区149bp区域(包括4个CpG二核苷酸位点(+456,+460,+466,+473bp)进行分析,设计亚硫酸氢盐PCR特异性和热测序特异性引物:

SDC2基因甲基化扩增引物



正向

5′- GGGAGTAGGAGTAGGAGGAGGAA-3′

反向

5′- Biotin-ACCAAAACAAAA CCAAACCTCCTACCCA-3′;

测序引物

5′-AGGAGGAGGAAGAGAG-3′

 

6.2 PCR体系:20ng亚硫酸氢钠修饰的DNA,基因特异性引物,反应体积25μL,用甲基化特异性PCR试剂盒扩增。

6.3 PCR反应设置:

94°C 10分钟,然后45个周期(94°C,30秒,56°C,45秒,72°C,40秒。然后将所有反应在72°C下孵育10分钟以进行最终延伸。

 

6.4测序:使用PyroMark ID96仪器和PyroMark Gold Q96试剂进行测序。简言之,PCR产物经生物素处理后,固定在链霉亲和素包裹的Sepharose HP珠上进行测序。

 

6.5测序数据处理:每个位点的C/T比值定义为该位点的甲基化指数(MtI),得出每个CpG位点的甲基化指数,然后计算出4个CpG位点的平均甲基化指数。非CpG的甲基化胞嘧啶被用作内部对照,以检查亚硫酸氢钠转化的保真度。

6.6阳性确定:如果样品的甲基化指数(MtI)大于焦磷酸测序检测限的5%,则认为是甲基化阳性。

 

7、meSDC2 LTE-qMSP的性能分析:

7.1 SDC2甲基化DNA的检测限(LoD)

7.1.1 阳性标准物质: HCT116基因组DNA

7.1.2阴性标准物质:人类淋巴细胞基因组DNA(未甲基化的基因组DNA)。

7.1.3梯度稀释:甲基化百分比为1.0、0.5、0.25、0.1、0.05和0%的混合物。

7.1.4检测限: 重复24次(同一天用同一台实时PCR仪独立运行3次,重复8次)。

检测限(LoD)


阳性对照

HCT116基因组DNA

阴性对照

人类淋巴细胞基因组DNA DNA

梯度稀释

1.0、0.5、0.25、0.1、0.05和0%

标准曲线


重复检测24次

估计出检出限

检测限

=10pg(约3个基因组拷贝)



 

8、粪便DNA甲基化测定(meSDC2-LTE-qMSP法)

为了测量SDC2甲基化,在步骤1中引入LTE,以便从亚硫酸氢钠修饰的DNA中特异性地富集甲基化的SDC2靶DNA。此外,COL2A1基因缺乏CpG二核苷酸的区域被用作对照[25],以估计可扩增模板的数量和亚硫酸氢盐转化是否充分。共20μL反应混合物,含有2.0μg亚硫酸氢钠转化的粪便DNA,每个0.05μM的SDC2甲基化特异反义和COL2A1基因特异反义引物连接到5′通用序列,以及4μL的5×AptaTaq PCR主混合物(Roche Diagnostics,Basel,Swiss)。循环条件为:95℃5min,35次95℃15s,60℃60s,LTE后反应混合物体积放大至40μL,含8μL 5×AptaTaq PCR主混合物,0.25μM SDC2甲基化特异性检测引物,0.125μM SDC2探针(FAM),0.125μM COL2A1检测引物,62.5nm COL2A1探针(Cy5),0.25μM通用序列引物。在Rotor基因Q实时PCR系统(德国希尔登桥根)上进行实时PCR。热循环条件为:95°C持续5min,然后40次95°C持续15s,60°C持续60s。加热和冷却速率分别为20°C/s和15°C/s。每次试验中,亚硫酸氢钠转化甲基化(HCT116)和非甲基化基因组DNA用作甲基化对照。也包括非模板控件。利用Rotor基因Q软件计算循环阈值(Ct)。

根据检测结果的受试者操作特性曲线(ROC)分析,选择了SDC2甲基化实时PCR检测中CT的临界值。在40岁时,确定了鉴别结直肠癌患者和健康人的最佳敏感性和特异性的最佳Ct值界限。因此,在解释LTE-qMSP法检测SDC2甲基化时,如果CT值在40个周期内,则如果SDC2甲基化的Ct值不可检测,则样本为阳性,并被视为阴性。用连续稀释的基因组DNA(HCT116)对COL2A1进行分析性能试验,检测限为10pg(约3个基因组拷贝),Ct值为36(数据未显示)。因此,只有当COL2A1的CT值≤36时,试验结果才被接受。

 



靶标

SDC2甲基化

内标

COL2A1基因

PCR体系1

反应物共20μL

PCR循环条件

95℃5min,35次(95℃15s,60℃60s)

PCR体系2

8μL   5×AptaTaq PCR主混合物,0.25μM SDC2引物,0.125μM   SDC2探针(FAM),0.125μM COL2A1检测引物,62.5nm COL2A1探针(Cy5),0.25μM通用序列引物。

热循环条件

95°C, 5min,然后40次(95°C,15s,60°C,60s。

Ct的临界值=40

根据检测结果的受试者操作特性曲线(ROC)分析

试验结果被接受

COL2A1的Ct值≤36时

 

9、统计分析

所有统计分析均使用MedCalc 9.3.2.0版(MedCalc软件,比利时奥斯特德)进行。P值小于0.05被认为具有统计学意义。计算ROC、ROC下面积(AUC)和95%可信区间(CI)。用Kruskal-Wallis试验比较甲基化水平和临床病理特征。



P值


ROC


AUC


95%   CI


甲基化水平和临床病理特征

Kruskal-Wallis试验(非参数性多重比较,相对于方差分析)

 

 结果与分析

患者特征

患者数 (%)

组织样本

粪便样本

健康对照

n=5

n= 22

 性别(%)

  男性

4 (80.0)

12 (54.5)

  女性

1 (20.0)

10 (45.5)

  年龄平均值和范围

55.5 (48–65)

58.8 (36–77)

息肉

n=49

n=21

 性别 (%)

  男

37 (75.5)

13 (61.9)

  女

12 (24.5)

8 (38.1)

  年龄均值和范围

57.2 (28–89)

63.4 (51–75)

 每个患者检出的息肉数量 (范围, 1–6) (%)

  1

21 (42.9)

3 (14.3)

  2–3

23 (46.9)

15 (71.4)

  ≥4

5 (10.2)

3 (14.3)

组织病理学分类

  Hyperplastic增生性

17 (34.7)


  Tubular管状的

27 (84.3)

21 (100)

  Tubularvillous小管绒毛

5 (15.7)


结直肠癌

n=18

n=50

 性别 (%)

  男

8 (40.0)

30 (60.0)

 女

12 (60.0)

20 (40.0)

  年龄均值和范围

63.1 (39–80)

61.9 (41–84)

 时期 (%)

  I

2 (10.0)

12 (24.0)

  II

12 (60.0)

17 (34.0)

  III

2 (10.0)

10 (20.0)

  IV

4 (20.0)

11 (22.0)

 

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亚硫酸氢钠焦磷酸测序法检测大肠组织中SDC2基因甲基化水平MtI。在正常黏膜(N)、增生性(HP)、腺瘤性息肉(Ade)和大肠癌组织中检测SDC2基因甲基化水平。每个样品的MtI用方框图和晶须图表示。用Kruskal-Wallis试验计算,腺瘤性息肉组与正常对照组、增生性息肉组与正常对照组、CRC组与正常对照组、CRC组与腺瘤性息肉组SDC2的MtI在<0.01时差异有统计学意义(说明SDC2甲基化水平随着肿瘤发展而升高,同时,同是肠癌患者,甲基化水平变异很大

 

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亚硫酸氢钠焦磷酸测序法检测大肠组织中SDC2基因甲基化水平。在正常黏膜(N)、增生性(HP)、腺瘤性息肉(Ade)和大肠癌组织中检测SDC2基因甲基化水平。每个样品的mti用方框图和晶须图表示。用Kruskal-Wallis试验计算,腺瘤性息肉组与正常对照组、增生性息肉组与正常对照组、CRC组与正常对照组、CRC组与腺瘤性息肉组SDC2的MtI在<0.01时差异有统计学意义

 

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粪便DNA中SDC2甲基化状态的meSDC2-LTE-qMSP检测。采用meSDC2-LTE-qMSP法检测不同时期结直肠癌患者、腺瘤患者(Ade)和健康正常人(N)粪便DNA。SDC2甲基化的相对水平分布在每个样本的CT值中表达为40-CT。较高的40-CT代表较高的SDC2甲基化水平。如果未检测到SDC2 CT,则表示为0。SDC2基因的甲基化状态用盒形图和晶须图表示。用Kruskal-Wallis试验分别计算CRC患者与正常人、腺瘤患者与正常人SDC2甲基化水平在**P<0.01和*P<0.05时差异有统计学意义。绘制了大肠癌患者与健康正常人的b-ROC曲线。甲基化阳性和AUC的临界值在图中显示

 

讨论

在此之前,作者发现SDC2基因的CpG岛在正常人中是不甲基化的而在结直肠癌患者(无论其分期如何)中它通常是甲基化的。我们随后证明,SDC2的异常甲基化状态可以在肠癌患者的体液(如血清和粪便)DNA中检测到[20,29],这表明SDC2有可能成为早期检测CRC的无创性分子诊断生物标记物。胃癌组织中常有SDC2高甲基化,SDC2异常甲基化与弥漫型和混合型胃癌相关[30]。SDC2高甲基化存在于HPV阳性的头颈部鳞状细胞癌和多型胶质瘤原发性肿瘤中[31,32],但SDC2甲基化检测的临床表现在这些研究中没有涉及。

在本研究中,作者试图建立结直肠癌特异性的粪便SDC2甲基化检测方法。证实,SDC2的异常甲基化发生在几乎所有的结直肠癌组织中无论其分期并且在各种癌前病变的活检中也观察到,而在正常粘膜组织中没有检测到组织标本中SDC2甲基化水平随病变程度的加重而升高


开发基于粪便DNA的高敏感甲基化DNA检测方法用于结直肠癌的早期检测具有很多挑战性,其中包括:

1、肿瘤脱落细胞:占比很低

2、细胞多样性:细菌DNA、食物DNA、其他细胞DNA

3、PCR反应抑制物:各种干扰/污染因子





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1 范振英

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