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蛋白磷酸酶95通过影响水稻磷酸盐的转运调控磷酸盐稳态

已有 2389 次阅读 2020-1-15 18:10 |个人分类:论文阅读日记|系统分类:科研笔记| 水稻, PT2, PT8, PHO2, PP95

蛋白磷酸酶95通过影响水稻磷酸盐的转运调控磷酸盐稳态

名称:PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affecting Phosphate Transporter                             Trafficking in Rice

期刊:Plant cell 8.631

第一作者:Zhili Yang

通讯作者:毛传藻 教授(浙江大学)

DOI:10.1105/tpc.19.00685

 

前言

磷吸收主要由PHT1s家族的质膜(PM)定位的Pi转运蛋白(PTs)介导,水稻中有13PHT1sOsPT8转录水平不响应Pi饥饿,敲除该基因抑制Pi由源到库的再分配过程,OsPT1/4Pi吸收和再分配同样发挥重要的作用。根中柱高表达的低磷诱导转运蛋白OsPT2在低磷条件下介导Pi吸收和根到地上部分的转运。

水稻OsPHO2不和PHT1家族的OsPT2/6/8互作,而与PHF1ER定位)互作,调控转运蛋白PMs由内质网ER向质膜PM的转运。磷充足条件下,OsPT2 OsPT8能够被酪蛋白激酶CK2磷酸化,抑制OsPT2/8PHF1蛋白的互作,造成PTs滞留在ER,抑制PTs靶向到PM上,减少Pi吸收。但是PTs是如何去磷酸化的尚不清楚。

 

结果

1、  OsPP95 PTs物理互作

蛋白磷酸酶是否参与PTs的去磷酸化过程,调控PTsERPM的转运?利用蛋白磷酸酶抑制剂处理转OsPT2/8-GFPOsCK2α3过表达植株(蛋白磷酸酶抑制剂)的水稻原生质体,发现GFP信号大多滞留在内质网,而未处理的原生质体GFP大多在PM上,但PPP型磷酸酶抑制剂没有该现象,表明蛋白磷酸酶是PTs去磷酸化和ERPM转运所必须的,且该磷酸酶为PP2C型抑制剂。

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作者利用以前研究的转录数据对90PP2Cs在水稻根中表达进行研究,剔除59个低表达基因,并利用OsPT8为诱饵蛋白,分裂泛素酵母双杂系统对31个候选基因筛选,OsPP95OsPT2/8互作蛋白,利用co-IPGST-pull downBiFC进一步验证表明OsPP95在体内外可以和PTs互作,互作区域为OsPP95N端的特异序列和PTsC端。

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2、  OsPP95在根和地上部分表达,且蛋白定位在所有亚细胞组分

  亚细胞定位表明OsPP95在所有亚细胞组分均有定位:核、胞质和ER

  组织特异性表达模式分析表明OsPP95在根、茎节和叶中表达。

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3、  OsPP95CK2拮抗调控Pi稳态

磷充足条件下,OE- OsPP95株系的根和地上部分的生长迟缓,老叶叶尖坏死(Pi中毒症状),Pi积累量升高;磷缺乏田间下OE- OsPP95株系地上和根鲜重降低,磷积累增多。

磷充足/缺乏条件下,ospp95 敲除株系生长状态均和野生型相似。磷充足条件下,ospp95 敲除株系地上和地下部分的鲜重相似,幼叶Pi积累量降低,老叶Pi积累量升高;低磷条件下,ospp95 敲除株系干重无差异,根中磷积累量下降,地上部分Pi积累量无显著差异,但幼叶Pi积累量降低,老叶Pi积累量升高。表明,OsPP95参与调节水稻Pi稳态和分布。

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  由于OsCK2OsPP95 都能与PTsC端互作,那么OsPP95OsCK2起拮抗作用?利用杂交的方式获得α3-Ri / OsPP95-OV α3-OV / OsPP95-OV 株系, α3-Ri株系的Pi积累量高于WTα3-Ri / OsPP95-OVPi积累量和α3-Ri株系相似,表明OsCK2OsPP95在同一遗传途径中调控Pi稳态。磷充足条件下,α3-OV / OsPP95-OV 株系的地上和地下生长状态比单过表达株系好,Pi积累量为:α3-OV<WT<α3-OV / OsPP95-OV <OsPP95-OV。表明OsPP95-OV缓解α3-OV的影响。

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    OsCK2也调控Pi分布?Pi充足条件下,KO- OsCK2α3株系在所有叶中的磷积累量上升,而OE-OsCK2β3转基因植株幼叶(第一二叶)磷积累量上升,而老叶(第三四叶)磷积累量降低。以上结果表明OsCK2OsPP95拮抗调节磷在不同叶的分布。

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4、  OsPP95直接去磷酸化PTs

体外磷酸化实验表明,OsPP95是一个Mn2+依赖型蛋白磷酸酶,具有磷酸酶活性。利用OsPT8特异性抗体检测OsPP95-OVα3-OV水稻ER中的磷酸化OsPT8α3-OV转基因植株OsPT8磷酸化程度高于野生型,显著低于OsPP95-OV株系,OsPP95-OV/α3-OV双过表达株系OsPT8磷酸化程度低于α3-OV转基因植株。且OsPP95Ser-517位点去磷酸化OsPT8

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5、  OsPP95CK2拮抗调节PTsER转移

通过检测α3-OVOsPP95-OVpp95突变体PT8ERPM分布水平发现,OsPP95-OV转基因株系在高磷状态下PT8主要在PM积累,而在ER上积累较少;pp95突变体在高低磷状态条件下在PM 积累较少,且在高磷状态下ER积累的更多。α3-OV转基因株系中PT8ER积累少,PM上积累多,而双过表达植株的PMER定位处于两个但OE之间。此外,OsPP95-OV/α3-OV / OsPT8-GFP的根表皮细胞中GFP信号主要在PM上,α3-OV / OsPT8-GFPGFP信号主要在ER上。表明,OsPP95CK2拮抗调节PTsER转移。

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6、  OsPP95蛋白在磷缺乏状态下比磷充足状态下更稳定

在磷缺乏状态和磷充足状态下,OsPP95的转录水平相似,那蛋白水平是否有差异? ProPP95:gPP95-GFP / pp95-10转基因植株在磷缺乏状态下的荧光信号强,且无磷条件下OsPP95蛋白随着时间的延长而不断增加,添加Pi后又迅速降低。蛋白合成抑制剂CHX处理高磷状态下生长植株的PP95-GFP 8h,蛋白几乎全部降解,而无磷状态下生长植株的PP95-GFP却没有。MG13226S蛋白酶体抑制剂)处理实验表明,OsPP95的降解依赖于26S蛋白酶体途径。

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7、  OsPP95蛋白的降解部分依赖于OsPHO2

利用酵母双杂对Pi泛素化相关的蛋白进行筛选,并经BiFC验证发现OsPHO2OsPP95互作。磷充足条件下,PP95-GFP / pho2 植株中OsPP95蛋白表达量多于PP95-GFP株系,而无磷条件下却相似。高磷条件下,CHX处理后PP95-GFP株系中PP96-GFP蛋白降解速度快,且PP95-GFP / pho2 植株泛素化的PP95-GFP少,表明OsPHO2通过泛素化途径参与OsPP95的降解。

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  为研究pp95 pho2的遗传互作,杂交获得pp95/pho2双突变体。磷充足时,双突变体的磷含量比pho2突变体低。pp95突变体在磷充足时的最嫩幼叶磷含量降低,而双突变体在前三嫩叶显著降低。磷酸化PT8蛋白在ER中的积累顺序: pho2突变体<pp95/pho2双突变体<WT<pp95突变体,而磷酸化PT8蛋白在PM的积累顺序:pho2突变体>pp95/pho2双突变体。表明OsPHO2通过OsPP95部分调控磷稳态和分配。

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总结

1、  OsPP95是正调控磷稳态的PP2CMn2+依赖型蛋白磷酸酶,其非保守的N端和OsPT8互作。

2、  OsPP95CK2拮抗性的调控PTsERPM的转运,且磷酸化/去磷酸化的位点均为Ser-517

3、  OsPP95调控磷转运和再分配,但幼叶和老叶的在转移的分子机理尚不清楚

4、  在磷充足时,CK2全酶(CK2α3和磷酸化的CK2β3)磷酸化PTs,抑制PHF1PTs的互作,与此同时PHO2降 解PP95,抑制PTs的去磷酸化阻止PTsERPM的转移。在磷缺乏时,CK2β3被降解,PHO2表达下调,PP95稳定性增强,去磷酸化PTs,促进PTsERPM的转移,增加Pi吸收。

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