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2个RING型E3泛素连接酶促进SPX4的降解,调控水稻磷酸盐稳态和信号途径

已有 2165 次阅读 2019-12-1 00:07 |个人分类:论文阅读日记|系统分类:论文交流| 水稻, PHR2, SPX4, SDEL1, SDEL2

2RINGE3泛素连接酶促进SPX4的降解,调控水稻磷酸盐稳态和信号途径

 

名称:Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate

Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice

第一作者:Wenyuan Ruan

通讯作者:易可可 研究员

第一单位:中国农科院农业资源与农业区划研究所

DOIhttps://doi.org/10.1016/j.molp.2019.04.003

 

摘要:

SPX蛋白在植物的无机磷感知,信号传导和转运具有重要的作用。水稻SPX4Pi缺乏时大量减少,但其降解机制不清楚。该研究利用Y2H筛选到两个和SPX4降解相关的RINGE3泛素连接酶蛋白SDEL1SDEL2SDEL12在细胞核和细胞质中均有定位,且具有E3泛素连接酶活性。在Pi充足条件下,PHR2SDELs竞争性的和SPX4结合,抑制SPX4的泛素化降解。在Pi充足条件下,过表达SDLE1/2提高Pi积累并诱导Pi饥饿信号传导;而sdle1/2突变体降低Pi积累并较少Pi饥饿信号转导。SDEL1/2通过调节SPX4蛋白的降解,进一步调节PHR2的活性,从而实现水稻外部Pi供应时对Pi稳态和Pi信号传导的调节。

 

前沿:

PHRs蛋白是植物Pi信号途径的关键调控因子,可以通过结合到PSIs基因(PHTsmiRNA399/827)启动子的P1BS顺势作用元件上调节对Pi饥饿的响应。SPXs蛋白负调控PHRs蛋白,其SPX结构域可以低亲和力地结合Pi,高亲和力地结合IPs,在高Pi或低IPs状态下和多种蛋白共同调节Pi转运和Pi信号。水稻中有6SPX蛋白,可以在Pi充足时和PHR蛋白互作抑制PHRsPSIs地结合,抑制PHRs的转录和活性。OsSPX4可以抑制PHR2的质核转移和与P1BS基序的结合,但SPX4的降解机制尚不清楚。

 

结果:

1、  SDEL1SDEL2具有E3泛素连接酶活性并可以泛素化SPX4

利用Y2H筛选到一个E3连接酶SDEL1 (Os12g35320),水稻中具有5个同源基因,其中SDEL2(Os03g22680)同源性最高。SDEL1SDEL2的表达模式和SPX4相似,在叶,根,茎,话要和穗中表达。水稻表达数据库和GUS报告基因系统表明SDEL1SDEL2的转录不响应Pi饥饿,但受无Pi状态诱导。

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利用Y2HBiFCCo-IP进一步验证表明, SDEL1SDEL2在体内外可以和SPX4物理互作,且SDEL1SDEL2SPX4均定位在细胞质和细胞核。体外泛素化实验表明:在E1E2存在时,SDEL1具有E3泛素连接酶活性(作者未纯化出SDEL2-His蛋白)。进一步研究发现,SDEL1介导SPX4的泛素化。

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2、  SDEL1SDEL2调控SPX4蛋白的稳定性

sdel1sdel2OE-SDEL1OE-SDEL2sdel1-sdel2双突变体(Pi缺乏状态下)中GST-SPX4蛋白进行细胞外降解实验表明,sdel1sdel2突变体中GST-SPX4蛋白的半衰期长于WT,双突变体更显著,而两个过表达株系的GST-SPX4蛋白的半衰期显著缩短,表明SDEL1SDEL2正调控SPX4的降解。当添加MG132时,sdel1-sdel2双突变体的SPX4泛素化水平显著降低,而OE-SDEL1/2株系中的SPX4蛋白的泛素化水平显著升高,表明SDEL1/2SPX4蛋白的泛素化至关重要。

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3、  SPX4K213K299赖氨酸残基是SPX4的主要泛素化位点

Y2H表明SDEL1可以和SPX4SPX结构域互作,SPX4结构域含有6α螺旋结构,其中第5和第6个是SPX4SDEL1互作所必须的。泛素化位点分析表明SPX4C端的赖氨酸残基是潜在泛素化靶位点。体外泛素化实验表明SDEL1可以泛素化SPX4K213K299赖氨酸残基。突变掉两个位点后进行蛋白体外降解实验发现,突变后蛋白的半衰期增长,表明K213K299赖氨酸残基对于SPX4降解十分关键。SDEL1通过和SPX4SPX结构域的第5/6α螺旋互作,泛素化K213K299赖氨酸残基,进而介导SPX4的降解。

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4、  SPX4-RHR2复合体抑制SDEL1的泛素化作用

体外泛素化实验表明,SDEL1不能泛素化PHR2,且IPs的添加不影响SDEL1SPX4的泛素化作用,但在IPs存在时,随着PHR2的增加,SPX4的泛素化逐渐降低,无IPs存在时,PHR2SPX4的泛素化抑制作用显著降低。WTphr1phr2双突变体和OE-PHR2SPX4的细胞外降解实验表明,OE-PHR2SPX4的半衰期显著降低,phr1phr2SPX4的半衰期增长。LCI报告系统实验表明共转PHR2时,nLUC-SPX4/cLUC-SDEL1的荧光信号显著降低。以上表明,PHR2SDEL1竞争性的与SPX4结合。

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5、  SDEL1 SDEL2正调控水稻Pi积累和Pi信号途径

Pi充足条件下,OE- SDEL1/2株系的根和地上部分的Pi含量增加,干重下降,PSIs基因的表达增加;sdel1/2缺失突变体的生物量下降,PSIs基因表达降低,sdel1-sedl2双突变体更明显,表明SDEL1/2在生长发育中发挥着关键作用,且正调控水稻Pi积累和Pi信号途径。

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讨论:

1、  sdel1-sdel2双突变体中的GST-SPX4稳定,但进一步孵化后还是可以降解,表明存在其他E3连接酶调控SPX4的降解;

2、  NBIP调控硝酸盐诱导的SPX4的稳定性,那么SDEL1NBIP之间是否存在一定的联系,调控NP信号途径;

3、  水稻中6SPX蛋白定位有差异,SPX3/4/5/6定位在细胞核和细胞质,SPX1/2定位在细胞核,且均能和PHR2互作,是否存在相似的降解模式?需要仅有研究其他SPXs蛋白的降解;

4、  SDELs-SPX4-PHRs的互作模型:在Pi充足时,SPX4PHRsIPs的协助下形成稳定的异源二聚体,阻止SDELsSPX4的泛素化降解,于此同时SPX4-IPs-PHRs复合体抑制PHRs的质核转移,阻止下游基因的激活;在Pi缺乏时,IPs含量下降,导致PHRs-SPX4二聚体的解体,积累的SDELs泛素化降解SPX4,释放的PHRs进入细胞核,与PSIs基因启动子上的P1BS基序结合,启动下游基因的表达,响应Pi饥饿。


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