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随着近几年大家对外泌体的认识和了解，外泌体吸引了诸多科学家的注意力，因其能够为癌症早期诊断和治疗提供有意义的生物标记物。那么对于研究外泌体的科学家来说，第一步，提取外泌体至关重要，今天我们分享一篇关于外泌体的提取方法到底对后续研究有什么影响？是否能给在做外泌体研究的你带来一些帮助。

这些年我们一起提取过的外泌体！

外泌体通常是30-120纳米的微小膜泡，具有脂质双分子结构，来自于几乎所有正常细胞和肿瘤细胞中多泡体（MVB）的管腔膜，它们被认为通过从原始细胞中装载蛋白质、代谢物和核酸（mRNA，miRNA）等物质，参与细胞之间的交流。这些蛋白质、代谢物和核酸（mRNA，miRNA）可以在与细胞膜融合后释放到细胞外间隙。外泌体上可以检测到许多细胞表面膜蛋白，其中一些可用于癌症的早期检测、诊断和预后。

常用的外泌体分离方法是超速离心，这种方法非常耗时耗力且需要一台超速离心机。例如还有其他的一些方法，免疫亲和，超滤法，化学聚合沉降法和凝胶过滤层析（size-exclusion chromatography，SEC）。

SEC是一种分离血液蛋白质中外泌体的理想方法。尽管有报道说这种过滤层析的方法本身有最低的外泌体载量的限制，但是SEC还是被广泛应用于临床样本的分析。

Table：外泌体的提取方法比较

血液样本外泌体我该如何选方法？

此研究中比较了3种分离方法，第一种包括使用多次超速离心的方法（UC方法），第二种方法商业qEV凝胶过滤层析柱，第三种方法也是120分钟的超速离心+qEV凝胶过滤层析柱过滤。

在使用层析过滤（SEC）这种方法时，每个SEC柱子过滤0.5mL的稀释血清，每个组分的洗脱液（0.5mL）被收集起来，然后每个组分中的蛋白通过使用BCA法测浓度，发现第9和第10次洗脱下来的蛋白与前面第8次的量多出很多。如下图统计图所示。

另外，通过投射电子显微镜发现3种方法从人血清中分离的外泌体具有相近的形态学和相似的大小分布。UC、UC&SEC和SEC方法分别分离的外泌体大小分别是67nm，75nm和77nm，具体参考下面图示。

研究外泌体蛋白的童鞋注意了，不同方法竟有这么大的差异？

随后作者使用超滤辅助样本制备法（FASP）对外泌体蛋白进行酶切，随后除盐后上机进行LC-MS/MS检测。用BCA法对每个样本的蛋白浓度检测后发现，通过使用SEC方法提取的外泌体蛋白量较多。在进行LC-MS/MS分析的过程都是使用同样1mL的上样量，数据分析3种不同提取方法的蛋白检测数，分别是495,474和347.

下图b中的皮尔森关联系数热图分析结果显示了每一种提取方法的重复性和差异性。

3种不同提取方法的外泌体标志物（CD9，CD63和CD81）相对丰度基本接近，UC&SEC方法提取的外泌体标志物相对表达量是纯粹使用UC的方法的1.3, 1.4和2.7倍。而另外3种分子标记物（ALBU，APOA1和APOB）检测发现SEC方法中其含量是纯粹使用UC方法的149.2,38.6和127.5倍。

原来不同提取方法有这么多差异？

那么方法不同还有这么大的差异，我该如何选呢？从上面的各个角度的研究看，超速离心（UC）方法最适合蛋白质组学研究，然而超速离心+SEC的方法更适合靶向的蛋白质组学研究，而单独使用SEC的方法很明显有较多的血清蛋白污染，对于研究外泌体蛋白组来说，有诸多不便，但是这种方法能够保留较多的外泌体蛋白量，更适合进行外泌体中RNA分析。

此研究虽然较为简单，但是帮助我们看到针对不同的外泌体研究，采取的提取方法还需慎重，事半功倍。

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