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[转载]Circ-Vav3作为gga-miR-375海绵能够促进上皮-间质转化

已有 698 次阅读 2019-3-19 16:26 |个人分类:文献解读|系统分类:科研笔记| 文献解读 |文章来源:转载

ALV-J 是一种能够在鸡群中通过水平传播、垂直传播或者通过遗传传播的高危致死性病毒,目前为止,还没有为 ALV-J 开发有效的疫苗,主要还是通过抗性筛选的方式繁殖鸡群。作者就该问题,通过建立circRNA文库及RNA-seq获得相关数据,结合实验验证 ALV-J 病毒侵染过程中关键途径的响应,提供一个新的治疗靶点。

 

该篇文献于1914日在线发表在 RNA Biology上,通过实验验证该团队在17年发表的circRNA数据文章中预测的结论。对circRNA – miRNA – mRNA 的实验验证手段有一定的参考价值。

 

研究背景

miR-375是一个研究明确的肿瘤 (肿瘤大小与入侵) 抑制miRNA,涉及多种类型的癌症。

Yes-associated protein 1 (YAP1, an ortholog of Yorkie) 是人类 Hippo 信号通路中重要的成员,在果蝇实验中验证,其能够控制组织生长及器官大小的功能。而在小鼠实验中,过表达YAP1,促进细胞生长及癌变。YAP1能够调节肿瘤的生存情况、参与上皮-间质转换 (EMT),该过程重要伴随 Fibronectin, N-cadherin, Vimentin, ZEB1, and MMP2蛋白水平上调以及E-cadherin下调。

Avian leukosis virus subgroup J (ALV-J), 属于逆转录病毒Orthoretrovirinae亚家族,Alpharetrovirus属的成员,能够导致鸡多种肿瘤、肾病以及成红细胞增多症。

 

主要材料与方法

样本及测序

13周鸡的 ALV-J-induced tumor livers (n=8) and normal livers (n=8) 用于验证基因表达水平。标准ALV-J NX0101strain用于侵染一周天的小鸡或者DF-1细胞。使用添加10%的牛血清的 Dulbecco’s 改良培养基培养细胞。

每组三个鸡 (十周) 肝脏样本用于提取总RNA,去线性RNA建库。The libraries were denatured as single-stranded DNA molecules, captured on Illumina flow cells, amplified in situ as clusters and finally sequenced for 150 cycles on Illumina HiSeq 4000 Sequencer according to the manufacturer’s instructions. GEO数据库编号:GSE99286

数据分析

数据分析内容在该团队前一篇文章中,其中circRNA的识别大致如下:

首先使用 cutadapt 对下机数据进行过滤, bowtie2用于对比到参考基因组上,find_circ用于识别circRNA。显著差异circRNA的阈值设定为 fold changes ≥ 2.0 with P-values ≤ 0.05

实验

实验方法主要包含RT-qPCRWestern blottingRNA immunoprecipitation biotin-coupled RNA pull-down and RNA-FISH assay、细胞培养及转染以及迁移实验。详细过程请参见材料与方法。

 

主要结果

circRNA结合位点预测

首先描述circRNA鉴定情况,作者从ALV-J感染鸡肝脏样本中挑选出25条上调的差异表达circRNA。结合前期工作中以报道 gga-miR-375 ALV-J感染鸡肝脏较正常肝脏显著下调 (miRNA microarry)。使用TargetScanmiRanda取交集预测miRNA结合位点,并使用miRanda 算法的socre进行排列,显示gga-miR-375 circ-Vav3 (chr8:1033880-1047222-)结合最为紧密,并绘制差异表达的circRNA/miRNA表达图谱。该预测结果已在前期工作中验证。

circRNA Sponges 验证

作者采用以下三种方式:RNA immunoprecipitation (RIP) , biotin-coupled RNA pull-down and RNA-fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) assays 来验证circRNAmiRNA互作。

首先作者通过AGO2 pulled down 实验(Fig. 2C and 2F)以及RT-qPCR检测AGO2 pull-down product (Fig. 2D, E, G, H),验证 circ-Vav3通过AGO2蛋白与 gga-miR-375结合。其次,使用生物素标记的 circ-Vav3探针及阴性对照探针检测是否能够 gga-miR-375 pull-down,并同样使用RT-qPCR检测其pull-down样本 (Fig. 2I, J)。最后通过DF-1细胞中,RNA-FISH实验检验 circ-Vav3gga-miR-375的亚细胞定位。

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miRNA与蛋白的互作验证

通过TargetScanmiRanda预测获得gga-miR-375的靶细胞 YAP1(Fig. 3A)。首先作者使用荧光报告基因分析确认gga-miR-375能够结合到 YAP1 mRNA 3‘ UTR区域。其次作者通过 gga-miR-375 mimic转染的DF-1细胞,24h后的RT-qPCR分析证实YAP1mRNA水平下调(Fig. 3D)48h后的Western blotting同样也显示过表达gga-miR-375 gga-miR-NC组能够抑止YAP1蛋白的表达(Fig. 3E)Fibronectin, N-cadherin, Vimentin, ZEB1, and MMP2蛋白水平不同程度的下调,而 E-cadherin蛋白水平上调 (Fig. 3F),并结合 RT-qPCR (Fig. 3G) 验证上述蛋白的mRNA表达水平。但是在TargetScanmiRanda预测中,这些蛋白的mRNA均不是gga-miR-375的靶基因,指出 gga-miR-375 影响EMT过程,可能通过一个直接的过程——YAP1途径所导致的。

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YAP1蛋白促进EMT过程

Transwell assays 显示,过表达YAP1与空载 (EV) 相比细胞数量增加并迁移到更低的区域 (Fig. 4A, B)48h过表达细胞与空载细胞的 Western blotting 分析,Vimentin, ZEB1, MMP2, Fibronectin and N-cadherin蛋白水平不同程度的提高,而E-cadherin水平下降25% (Fig. 4C),而24hRT-qPCR 对对应的mRNA水平检测也获得了相同的结果(Fig. 4D)。说明YAP1蛋白能够促进EMT过程及细胞迁移。

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circ-Vav3 - gga-miRNA-375 - YAP1调控关系的验证

首先作者先验证circ-Vav3载体导入 gga-miRNA-375过表达的DF-1细胞中的表达情况 (Fig. 5A),随后通过定量 (Fig. 5C, D) Western blotting (Fig. 5B)验证,结合前人研究结果参与EMT过程中YAP1蛋白水平上调,说明 circ-Vav3 能够作为 gga-miRNA-375海绵,通过上调gga-miRNA-375的靶基因 YAP1蛋白促进EMT过程。

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ALY-J的体外侵染实验

侵染12hcirc-Vav3水平上调,导致gga-miR-375总体下调42% (Fig. 6A),虽然单独与mock比较,gga-miR-375表达水平上调1.78 (Fig. 6B)48小时后的western blotting实验结果显示,YAP1, Vimentin, ZEB1, MMP2, Fibronectin and N-cadherin具有不同程度的上调,而E-cadherin则出现下调 (Fig. 6C)24h YAP1 mRNA水平上调,而且有的相关的蛋白变化趋势相同 (Fig. 6D-E)。这些结果证明,体外ALV-J侵染后将降低 gga-miR-375E-cadherin的水平,而YAP1, Vimentin, ZEB1, MMP2, Fibronectin and N-cadherin水平升高。并通过检测 ALY-J 临床样本中circRNA及相关蛋白的表达趋势,验证体内响应 (Fig. 6F-K)

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小结

结合前人的研究结果,作者验证了 ALV-J 侵染鸡后的一系列响应变化。如下图所示,ALV-J 侵染后上调 circ-Vav3,导致gga-miR-375下调,从而使 YAP1蛋白上调,诱导 EMT过程,最终导致肿瘤发生。

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转自生信草堂公众号,已授权

文献请在公众号获取~



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