替代固氮酶对土壤中非共生固氮菌固氮可能的贡献

Possible contribution of alternative nitrogenases to nitrogen fixation by asymbiotic N₂-fixing bacteria in soils

Impact Factor：5.290

https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2013.11.015

发表日期：2013-12-03

第一作者：J.P. Bellenger^a,*

通讯作者：J.P. Bellenger(jean-philippe.bellenger@usherbrooke.ca)^a,*

合作作者：Y. Xu,X. Zhang,F.M.M. Morel,A.M.L. Kraepiel

主要单位：

^a美国普林斯顿大学Guyot Hall PEI地球科学系(Department of Geosciences, PEI, Guyot Hall, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA)

写在前面

分享标题：SBB：替代固氮酶对非共生固氮可能的贡献

关键字：固氮，乙炔还原法，¹⁵N方法，替代固氮酶，钼(Mo)，钒(V)

点评：固氮酶，其具有三种同功酶，以活性部位的过渡金属为特征:钼(Mo)-固氮酶，这是该酶的典型形式，和钒(V)及铁(Fe)的固氮酶，有时被称为替代固氮酶，迄今为止，所知的所有能固定N₂的细菌都具有Mo-固氮酶，但只有一部分细菌同时具有V-固氮酶或Fe-固氮酶的基因，或者两者兼而有之。替代(V-和Fe-only)和经典的(Mo-)固氮酶对自然环境中氮气固定的相对贡献在很大程度上仍是未知的。这里作者结合化学和分子方法检查它们在陆地生态系统中扮演的角色。衡量环境中N₂固定速率的常用方法有两种：同位素标记的氮15饲喂法，乙炔还原法，因都有各自的缺点，因此作者使用R比对这两种方法得出的测量结果进行比较，并详细的论述了固氮过程中电子传递计量数的问题，且对开发R比(定义为R=乙炔还原速率/固氮酶的氮气固定率)作为研究自然生态系统中替代性固氮酶可能作用的工具做了一些工作，作者通过纯培养研究表明,虽然R比是高度可变的,但低R比(0.5<R<2)通常是替代固氮酶活性的指标。

亮点

• 我们研究了替代固氮酶在陆地生态系统中的作用。
• 替代固氮酶在培养中显示出低的R比(C₂H₂还原/N₂固定)。
• 低R比表明了替代固氮酶在微观世界中的作用。
• Mo-和V-固氮酶基因在微宇宙实验中得到表达。
• 公布的R比表明了土壤中替代固氮酶的活性。。

摘要

替代(V-和Fe-only)和经典的(Mo-)固氮酶对自然环境中N₂固定的相对贡献在很大程度上仍是未知的。这里我们结合化学和分子方法检查它们在陆地生态系统中扮演的角色。纯培养研究表明,虽然R比(定义为R=乙炔还原速率/固氮酶的N₂固定率)是高度可变的,但低R比(0.5<R<2)通常是替代固氮酶活性的指标。在温带土壤上进行的微域实验显示出较低的R比和响应于钒修饰的N₂固定率的大幅提高，表明了V-固氮酶的活性。使用RT-PCR，我们能够证明V-固氮酶和Mo-固氮酶共同在这些土壤中表达。对已发表的R比的分析表明，替代固氮酶对土壤中非共生N₂固定的贡献可能比我们以前认识的更为普遍。

背景

生物固氮是将氮气体还原成生物可利用铵的反应，可以说是地球上最重要的反应之一。固氮酶，负责固氮的酶，其具有三种同功酶，以活性部位的过渡金属为特征:钼(Mo)-固氮酶，这是该酶的典型形式，和钒(V)和铁(Fe)的固氮酶，有时被称为替代固氮酶。Mo-固氮酶的比活性高于替代固氮酶，且在有Mo时优先表达。迄今为止，所知的所有能固定N₂的细菌都具有Mo-固氮酶，但只有一部分细菌同时具有V-固氮酶或Fe-固氮酶的基因，或者两者兼而有之。替代固氮酶的基因似乎在土壤中无处不在，温带和热带土壤中N₂固定的Mo限制的发生表明，替代性固氮酶有时可能有助于N₂固定。但是，目前尚缺乏直接的陆地和/或海洋生态系统中替代固氮酶活性的证据。

衡量环境中N₂固定速率最常用的方法之一是所谓的¹⁵N₂方法，其中将样品(水，土壤或沉积物)与¹⁵N₂气体一起培育，并且随着时间的推移我们对颗粒相中¹⁵N含量的增加进行监测。这种方法最近被发现容易产生与同位素标记的N₂气体在水样中缓慢溶解有关的伪迹。在N₂固定率低的沉积物和土壤样品中，由于难以测量将新的¹⁵N₂掺入到含有大的¹⁵N含量背景的样品，因此¹⁵N₂方法也可能具有高的检测限。

另一种常用的方法是乙炔还原测定法(ARA)，其中将样品与乙炔一起孵育，然后使用固氮酶将乙炔还原成乙烯的速率来评估N₂的固定速率。该方法非常灵敏(特别是对于土壤和沉积物样品)，并且易于在野外实验中使用。但是，它受到了一些批判，其中包括将乙炔还原(AR)速率准确转换为N₂固定速率的能力。

可以使用R比对这两种方法得出的测量结果进行比较，R比值是乙炔还原(AR)速率与N₂固定率的比值。基于半氧化还原反应(1)和(2)，固氮反应中每个N₂分子需要8个电子，而乙炔还原仅需要2.5个电子。注意到，很大一部分电子通量被转移到H₂的产生。

因此，假设R比与每个反应所需的电子数直接相关，则R的理论值为8/2.5=3.2。实际上，测得的Mo-固氮酶的体外和体内的R比值接近4，与理论比值非常吻合。

相反，据报道，来自陆地和海洋系统的天然样品中的R比的实验值在很大范围内变化，从小于1到超过30。影响R值变化的因素有很多，如环境胁迫、被同化标记的¹⁵N在溶解相的排泄和产氢。此外，早在Mohr等人论文发表之前的许多研究可能会高估R比的值，因为¹⁵N₂不完全溶解在水样中会导致低估N₂固定率。

有趣的是，大多数用来解释R比变化的因素都倾向于增加R的值。可能导致低R值但经常被忽略的因素是样品中活跃的固定氮的固氮酶的类型。

如上所述，固氮酶将N₂还原为NH₄时，一部分电子通量被系统地转移至H₂的生产中。重要的是，替代固氮酶中的分流通量的大小要比钼固氮酶中的大。对于V-固氮酶，N₂固定和乙炔还原的平衡反应为：

因此，V-固氮酶的理论R比为12/5＝2.4。仅含铁的固氮酶反应的化学计量尚不清楚，但很可能产生更低的R比。事实上，在体外，仅含钒和铁的固氮酶的R比率接近于1。这些在体外观察到的替代固氮酶的低R比值表明，该低R比可作为野外替代固氮酶固定N₂的暗示。当前唯一可用于检测替代固氮酶活性的其他方法包括测量ARA中乙烷的产量。不幸的是，由替代的固氮酶产生乙烷的速率只是乙烯产生速率的几个百分点。与实验室培养相比，田间样品的AR率低，因此无法利用我们分析方法的当前检测限检测乙烷。

为了开发R比作为研究自然生态系统中替代性固氮酶可能作用的工具，我们首先在纯培养物中培养了固氮细菌，以验证活体内的R比的值。然后，我们在温带土壤中进行了微宇宙实验，以确定金属(Mo或V)有效性的变化是否会导致N₂固定率和R比值的变化。最后，我们编辑并分类了R比值的公布值，以识别基于所测量比值的生态系统类型的潜在趋势。

结果与讨论

固氮菌纯培养中的R比

R ratio in pure cultures of N₂-fixing bacteria

我们测量了A. vinelandii和R. palustris的纯培养中的R比(图. 1)。A. vinelandii是一种异养需氧型能固定N₂的土壤γ变形杆菌。R. palustris是一种在厌氧和光异养条件下生长的且能固定N₂的α-变形细菌。选择这两种细菌是因为它们具有不同的代谢和氧气需求。

图 1 A.vinelandii(A)和R.palustris(B)培养物中的R比率(乙炔还原率/N₂固定率)。

R (acetylene reduction rate/N2 fixation rate) ratio in cultures of A. vinelandii (A) and R. palustris (B)

误差棒对应于标准偏差。Mo-Nase：仅含Mo的突变体或与添加Mo一起生长的野生型(WT)的培养物；V-Nase：仅含V的突变体或与添加V(只有V，没有Mo)一起生长的野生型(WT)的培养物；Fe-Nase：与添加Fe(只有Fe，没有Mo与V)一起生长的野生型(WT)的培养物。R比是在指数(exp)或稳定(st)生长期间测量的。根据单尾的方差分析(ANOVA), HolmeSidak,P<0.05，相似的字母表示无显着差异。

为了确定固氮酶同工酶的类型如何影响R比值，我们在各种金属条件下培养了野生型菌株(+Mo+Fe有利于钼固氮酶，+V+Fe有利于钒固氮酶，+Fe有利于只有铁的固氮酶)。我们还培养了仅表达Mo固氮酶(仅有Mo的突变体)或仅表达V固氮酶(仅有V突变体)的A. vinelandii和palustris突变体，并测量了指数生长期和稳定生长期的R比。

指数生长的Mo-固氮酶野生型和突变型的R值分别为3.5±1.1(对于A.vinelandii)和4.4 ±1.7(对于R.palustris)(图 1)，这与R的理论值一致。在R. palustris和A. vinelandii培养物的稳定期和指数期测得的R比没有观察到显着差异(单尾方差分析，P<0.05)。

在以V-固氮酶进行培养的两种细菌培养物的R比均显著低于以Mo-固氮酶进行培养的R比(在A. vinelandii中R=1.2±0.4，在
R.palustris中R=2.0±0.05)。在R. palustris中未观察到生长期的影响。尽管仅基于一种测量，但是在稳定期的A. vinelandii培养物中R比率有很大的增加。仅在A.vinelandii的指数生长期的培养物中测量的仅有铁的固氮酶的R比显示出具有比V-固氮酶更低的R比率(R=0.5±0.3)。

有趣的是，在这项研究中测得的体内R比与文献中报道的固氮酶同工酶的体外R比值之间没有显着差异。

尽管R比显然是可变的，并且受多种因素影响，但令人惊讶的是，在我们的实验中多种变化的因素中(例如，细菌代谢，需氧与厌氧的N₂固定，生长期和固氮酶同工酶的类型)，导致R值低于2的唯一的原因是通过V-固氮酶或Fe-固氮酶固定N₂。因此，培养物中的低R比(R <2)似乎表明了替代固氮酶的活性。

微域实验中典型和替代性固氮酶的存在与表达

Presence and expression of canonical and alternative nitrogenases in microcosm experiments

在第一个实验系列中，用2％蔗糖(+C)或2％蔗糖和100 ppm钼(+C+Mo)，或2％蔗糖和100 ppm钒(+C+V)处理土壤，并在数天内检测AR率。在所有培养中，AR率都遵循类似的模式(图. 2)。在添加营养物后约两天，它们保持在低水平，然后升高并保持数天。最终，它们在一天或更短的时间内下降，在其余的实验中保持较低水平。+C和+C+Mo处理之间的AR率无显着差异，但相较于与+C+Mo处理，+C+V处理导致AR率的显着增加(第4天到第7天之间~+60％，P<0.05，图2)。

图 2 在Stony Ford野外监测站收集的改良土壤的乙炔还原率

Acetylene reduction rates in amended soils collected at the Stony Ford field station

用C(黑色圆圈)，C+Mo(空心圆圈)或C+V(黑色三角形)处理的土壤。值(±标准误差)代表重复进行的三个独立实验的平均值(第2、4和10天为n=4，第3、5、6、7和8天为n=6)。对于第5、7和8天，根据单尾方差分析(ANOVA)Holm-Sidak，P<0.05，[(+C)=(+C+Mo)]不等于(+C+V)。对于第6天，(+C)=(+C+Mo)，(+C)=(+C+V)和(+C+Mo)不等于(+C+V)。

为了确定AR率的这种小增加是否对应于固氮率的增加，我们一式三份的进行了与图2中描述的相似的另一项实验。仅对土壤进行了两种处理(+C+Mo和+C+V），并且随时监测AR率(使用AR分析)和N₂固定率(使用¹⁵N₂方法)(图. 3)。我们还对固氮酶基因(nifH)进行了调查，以确定金属处理如何影响固氮细菌的群落。

图 3 在Stony Ford野外监测站收集的经修饰土壤中的乙炔还原率(A)，固氮率(B)和R比(C)。

Acetylene reduction rates (A), Nitrogen fixation rates (B) and R ratios (C) in amended soils collected at the Stony Ford field station

用C+Mo(空心圆圈)或C+V(黑色三角形)修饰的土壤。值(±标准偏差)代表三个实验的平均值。+C+Mo处理的第6天后和+C+V处理的第8天后的固氮率低于检测值。

AR率遵循与图2中描述的实验相似的模式，但是由于未知原因，总体比率较低，尤其是对于+C+Mo处理而言(图. 3A)。在这一系列实验中，+C+V改良土壤的AR率比+C+Mo改良土壤高3-4倍。在孵育开始时，R比值较低。两种处理中它们随时间的推移均增加，但+C+Mo处理中的值高于+C+V处理中的值(图. 3C)。在第3天和第6天对+C+Mo和+C+V修饰处理中的nifH基因进行分析后，发现两种处理之间这些基因的多样性没有显着差异，因为相同的4种表现型(nifH，nifH1，nifH50和nifH2)占了每个处理的大部分序列，表明有相同的生物存在。许多序列似乎与植物相关(55%在+C+Mo，65%在+C+V的处理上)。在乙炔还原和N₂固定率中观察到的差异似乎是由于相似细菌群落表达了不同的固氮酶同工酶。

在微域培养开始时测得的低R比值以及响应于V添加的乙炔还原率和N₂固定率的增加表明，微域中V-固氮酶的重要参与。这一发现得到了一些辅助数据的支持：1-土壤中的低Mo含量(77ppb)，低于巴拿马热带森林中测得的平均Mo浓度(110ppb)，其中显示Mo限制了N₂的固定;2-在+C+Mo和+C+V处理中乙炔还原测定过程中乙烷的产生(数据没有被显示)；3-RT-PCR法测定的Stony Ford土壤中V-固氮酶基因的表达(看下面的)。

令人惊讶的是，Mo改良土壤的N₂固定率低于V改良的土壤。但是，+C+Mo培养5天后的R比值比+C+V处理高。这些数据表明，固N₂群落从V-固氮酶(这可能是在添加金属之前使用的)转换为Mo-固氮酶花了几天的时间。+C+Mo处理中的N₂固定率并未如预期的那样增加，这可能是因为在完成转换之前，其他土壤细菌已经消耗了可用的碳源。相反，当向土壤中供应V时，非共生固氮群落能够立即使用它，从而导致持续几天的高的N₂固定率。这解释了+C+V处理中高的N₂固定率，尽管V-固氮酶比Mo-固氮酶的特异活性低，并且每个固氮分子消耗的ATP都多于Mo-固氮酶(40个ATP与16个ATP)。我们还注意到，+C+V处理微域中R比率的增加可能反映了固N₂群落随时间从指数生长期到稳定生长期的变化(图. 1)。另外，R比的增加可能反映了Mo-固氮酶对N₂固定的贡献随着时间的推移而增加，但是对+C+V处理的如此反应不太可能。

为了验证Stony Ford土壤中其他固氮酶的存在，我们研究了其他固氮酶的基因和基因表达。nifH基因在我们的微域实验中用作指示固定N₂群落多样性的指标(见上文)，其编码固氮酶组分II的结构基因，是自然环境中N₂固定群落研究中最常用的序列功能基因。但是，它不能根据固氮酶同工酶的类型聚类，并且不可能仅基于它们的序列来区分nifH，vnfH和anfH(分别对应于Mo-，V-和Fe-only固氮酶)。相比之下，系统发育分析表明，分别编码仅含Mo，V和Fe的固氮酶中的固氮酶I部分的nifD，vnfD和anfD形成了三个不同的进化枝。

因此，我们设计了nifD和vnfD/anfD的引物，并用它们来研究在StonyFord野外站收集的土壤样品中替代固氮酶的存在和活性，并用固定碳源(蔗糖)孵育5天以刺激固氮活性。使用PCR和RT-PCR技术，成功地从土壤样品中提取的DNA和RNA中扩增了部分nifD和vnfD基因和转录本。然后将扩增子克隆并测序。通过nifD引物扩增的部分nifD转录本与A. vinelandii的相应nifD序列具有67-87％的同一性，但与vnfD和anfD固氮酶序列仅具有30-32％的同一性。通过vnfD/anfD引物扩增的部分vnfD基因和转录物与A.vinelandii的对应vnfD序列具有89％的同一性，与A. vinelandii 的nifD具有30％的同一性。推导的蛋白质序列的系统发育分析(图4)证实了nifD和vnfD/anfD引物对回收各自序列类型的特异性。来自土壤微域世界的大多数(6个中的5个)表达的nifD序列编码与植物相关的固氮菌聚集的蛋白质，这与nifH分析中植物相关基因的优势一致。来自土壤的vnfD基因和转录物形成一个单一进化枝，与生活在土壤和沉积物环境中的自生固氮菌A. vinelandii和R. palustris密切相关。但是，随着更多序列的获得，这些推论的系统发育关系可能会发生巨大变化。尽管设计了引物来扩增vnfD和anfD基因，但我们仅从土壤样品中回收了vnfD基因，这与我们对V刺激的固氮微生物的观察结果一致。据我们所知，这是第一个报告土壤样品中替代固氮酶表达的研究。典型固氮酶和替代固氮酶似乎都得到了表达，这表明在这些土壤样品中至少有两种不同的固氮酶同工酶参与了N₂的固定。这一致与先前的研究，其表明在纯培养物中，两个基因均在金属充足和钼限制的条件下表达，尽管相对表达水平随细菌细胞的金属状态而发生巨大变化。因此，这些实验证实了在Stony Ford中其他固氮酶的存在和表达。

图 4 从土壤微域世界中回收的NifD(“NifDcDNA”)和VnfD(“VnfanfDNA”和”Vnfanf_cDNA”)序列的蛋白质系统发育

Protein phylogeny of NifD (“NifD_cDNA”) and VnfD (“Vnf_anf_DNA” and “Vnf_anf_cDNA”) sequences recovered from soil microcosms

星号突出显示cDNA序列。该树由169个MUSCLE对齐的氨基酸和ARB软件环境中的Fitch距离分析方法构建而成。实心圆右边的进化枝由树构建的距离和蛋白质最大似然法(Phylip PROML)支持。比例尺指示每个比对位置氨基酸变化0.1个单位。序列以登录号KF772832，KF772833和KF772848eKF772854保藏在Genbank中。

海洋和陆地生态系统中的R比

R ratios in marine and terrestrial ecosystems

Sony Ford的微域实验结果表明V-固氮酶对非共生N₂固定有重要贡献，为了确定该结果是否可能适用于其他生态系统，我们汇总了已发表的田间研究中可用的R比数据，这些田间研究测量了乙炔还原率和固氮率(图. 5)。我们根据所研究的生态系统类型整理了数据(海洋，植物根部共生体，土壤)。在海洋系统中，大多数样品的R比在6-7范围内，次要峰在2-3和4-5范围内(图. 5A)。这些值在我们的以Mo固氮酶生长的固氮菌的纯培养物中的体内测量值的较高范围内(图. 1)。这可能部分反映了¹⁵N₂气泡的缓慢溶解造成的实验假象，但也可能反映了蓝细菌中较高的R比(数据未显示)。

图 5 文献中的R(乙炔还原率对N₂固定率)比率。

R (acetylene reduction rates to N2 fixation rates) ratios in the literature

(A)海洋生态系统，(B)高等植物中的共生固氮(仅考虑附有根瘤的研究)和(C) 土壤样品。灰色柱子表示Mo固氮酶的预期R比率(R比率~3-4)和其他固氮酶的预期R比率(R比率~1)和[海洋，植物，土壤]

在根瘤中，大多数R比在3-4范围内(图. 5B)。在根瘤中测得的R比率显示出三种生态系统的最小变化。但是，值得注意的是，我们仅对仍附着在寄主植物上的根瘤进行了测量；分离的根瘤的R比趋于更可变(0.95-5.2)。

相反，在土壤中的自生细菌中测得的R比变化很大，范围从小于1到6或更大，大多数值集中在3-4范围内(图. 5C)。然而，引人注目的是，R比值的分布在1-2范围内显示出一个明显的峰值，这在其他生态系统中是不存在的。根据图1的数据，这可能是其他固氮酶活性的迹象。我们认为在陆地生态系统中的自生固氮菌中V和Fe固氮酶有时可能很重要，因为土壤中Mo稀缺(通常在ppm范围内)，而V和Fe相对更丰富(V ~ 500-100 ppm，Fe ~ 1-10%)。确实，在热带和温带生态系统中已经证明了N₂固定的Mo限制。通常在海洋和植物共生体中未测量出低比率值的事实与该假设一致。替代的固氮酶在海洋表面不太可能是重要的，因为那里的Mo是丰富的，有利于Mo-固氮酶的使用。此外，被认为是造成海洋表面N₂固定的主要贡献者的Trichodesmium和Crocosphaera并不拥有替代固氮酶的基因。使用来自A. vinelandii的vnfD序列作为查询，对Crocosphaera watsonii WH003和Trichodesmium
erythraeum IMS101的 基因组进行的BlastP分析获得了nifD序列作为最热门的结果。这些<= 35％与vnfD相同。同样，与高等植物形成根瘤共生的Rhizobium 和Frankia仅具有Mo-固氮酶同工酶的基因。

结合化学方法测量R比值和分子方法确定基因表达，我们能够证明土壤中替代固氮酶的重要性。根据我们对已发表数据的分析，通过自生固氮菌固氮的很大一部分是由替代固氮酶贡献的。我们注意到我们的分析往往低估了替代固氮酶的作用，因为我们将高R值(>2)解释为表示经典的Mo-固氮酶的活性，尽管我们的实验室数据显示替代性固氮酶在某些条件下也可以产生较高的R值。在我们的Stony Ford实验中，在V修饰土壤与Mo修饰土壤中测得的较高固氮率挑战了我们目前对土壤中固氮细菌中仅含Mo、V和Fe的固氮酶的控制、表达和使用的理解。

材料与方法

菌株和生长条件

Bacterial strains and growth conditions

在这个实验中我们使用了两种自由生活的(非共生)固氮菌Azotobacter vinelandii(OP，Lipman 1903)和Rhodopseudomonas palustris。研究了四株A. vinelandii菌：野生型菌株OP(ATCC 13705)和双缺失突变株CA1.70(仅Mo-氮酶，DvnfDGK：spc，DanfHD70：kan)，CA11.70(仅V-氮酶，DnifHDK DanfHD70：kan)和RP1。 11(仅铁固氮酶，DnifHDK DvnfDGK：spc)。研究了三种R. palustris菌株：CGA009
(野生型), CGA753 (仅有Mo-固氮酶, DvnfH DanfH), CGA766
(仅有V-固氮酶, DnifH nifD:Tn5 DanfA)。所有培养物均固氮生长。A. vinelandii生长在如前所述有氧的液体培养基(22°C, 180 rpm)中。在厌氧光异养条件下，R. palustris被分批培养在含有10 mM琥珀酸盐的特定N₂固定培养基中。

微域实验

Microcosm experiments

为了调查陆地生态系统中替代固氮酶的活性及R值，我们在普林斯顿的斯托尼福特野外站进行了研究(Princeton, NJ,
40°21’15’’N-74°43’12’’E)。我们在混合硬木温带森林中收集了土壤样品。2009年9月上旬，我们在4平方米的表面积上收集了A地平面(深度为4厘米)约10公斤的土。收集的地平面土由富含有机物的物质组成，其结构受蚯蚓活动的影响很大。收集当天的含水量约为40％。将土壤过2 mm筛，均质并在4° C下储存。未经修正的土壤中mo和v的含量分别为77ppb和62ppm(详见第2.5节)。将土壤子样品(w100g)转移到1 L广口瓶中，向其中加入NaCl(0.1％w/w)，蔗糖(2％w/w)和金属(100ppm的钼酸盐或钒酸盐，来自高纯度盐，Sigma)。广口瓶用Parafilm覆盖以防止干燥。然后将土壤样品在室温下孵育13天，并随时间的推移监测Ar(乙炔还原率)率和N₂固定率，如下所述。在三个独立的实验中，每种金属处理均重复进行两次。

ARA 与¹⁵N₂方法。

ARA and ¹⁵N₂ method

使用ARA和¹⁵N₂方法测量纯培养物中A. vinelandii和R. palustris的乙炔还原率和固氮率。在一个典型的实验中，在指数中期生长阶段收集了50 mL培养物；5 mL用于测量AR率，40 mL用于¹⁵N₂法测量N₂的固定率。所有实验都做一次重复。

对于AR分析，将5 mL细胞悬液置于60 mL装有空气和乙炔混合物(空气与乙炔的比例为10：1(v/v))的小瓶中孵育。定期收集顶空试样，并使用气相色谱仪 (Shimadzu GC-8A 配备有 一个 Supelco HayeSep N柱, 80/100 mesh, 2M*1/8 in SS 和一个FID检测器)测量乙烯(C₂H₄)的产生。实验期间C₂H₄的产生速率呈线性。

使用基于Mohr等人(2010年)的¹⁵N₂示踪法测量N₂固定率。 我们通过首先在真空条件下,在隔膜玻璃瓶中对培养基进行脱气，然后注入¹⁵N₂气体，来制备¹⁵N₂示踪富集分析培养基。然后将瓶子放在振荡器上过夜。重复此步骤3次，以确保¹⁵N₂完全替代¹⁴N₂。为了测量N₂固定率，将40 mL细胞悬液转移至240mL小瓶中，然后注射4ml的¹⁵N₂示踪剂富集分析培养基，再注入¹⁵N₂气体(1：(v/v)¹⁵N₂与空气的比例)于顶空。假以时日，通过在燃烧的GF/F滤器上过滤收集细胞，并在稳定性同位素仪 (UC Davis)上通过同位素比质谱法分析细胞的¹⁵N含量。使用类似的方法测量土壤样品中的乙炔的还原和固氮率。对于ARA，将100 g土壤(湿重)置于一个1L的装有空气和乙炔混合物(空气与乙炔的比例为10：1(v/v))的广口瓶中培育。在6-8小时内定期收集气体样本(8ml)，并将其储存在预抽真空的8ml血清瓶中，直至用气相色谱法分析(见上文)。对于固氮率，将三个土壤试样(5 g，湿重)转移到20mL小瓶中，该小瓶中包含空气和¹⁵N双标记的N₂(空气与¹⁵N₂的比例为10：1(v/v))的混合气体，培育0、8和14小时，然后在60°C下干燥。将干燥的土壤均质化并收集子样品(~30mg)以分析其¹⁵N含量(见上文)。

RNA提取和cDNA合成

RNA extraction and cDNA synthes

收集2g土壤，在液氮中速冻并在-80℃下保存直至提取。按照制造商的指示，使用RNA PowerSoil总RNA提取试剂盒和DNA洗脱试剂盒 (MO BIO, Carlsbad, CA)从土壤中提取RNA和DNA。对于RNA，按照制造商的说明使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行第二次提取。提取的RNA用DNase I(Invitrogen)处理以消除基因组DNA污染，并使用SuperScript III第一链合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。

土壤中的金属浓度

Metal concentrations in soils

在微波消化器(MARS，CEM公司)中用5 mL浓硝酸(Optima)消化大约0.5 g的土壤。将消化物离心以除去任何残留的颗粒。将得到的上清液用milli-Q水(1mL上清兑12.5mL水)稀释至5%的硝酸终浓度，然后用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS, Element 2, Thermo Finnigan)在中分辨率下分析。

固氮酶基因扩增

Nitrogenase gene amplification

我们基于Genbank数据库中的许多同源基因序列，设计了简并引物来扩增部分nifD，vnfD和anfD基因(500-700个碱基对)。通过巢式PCR扩增部分nifD和vnfD/anfD基因。对于nifD基因，引物nifD820F(CAC TGC TAY CGB TCG ATG AAC TAC)和nifD1389R(GAT GTC RCG SGC GAA GAT)用于第一轮PCR，nifD820F和nifD1331R(CAG GAG TGC ATY TGV CGG)用于内部PCR扩增。由于vnfD和anfD基因彼此具有高度相似性，因此我们打算设计引物来扩增这两个基因。引物vnfD_anfD548F(TSA AYA TCG SCT GGR TSA)和vnfD_anfD1337R(GCG TTR TAV ATR TCK CGS GC)用于第一轮PCR，而vnfD_anfD548F和vnfD_anfD1291R(TGT ANG GRC CRT TGT GRT A)用于内部PCR扩增。用Phusion DNA聚合酶(NEB, Ipswich, MA)进行PCR扩增。热循环条件为98℃2分钟，然后以98℃10s，50℃30s和72℃30s进行35个循环，最后72℃5min延伸。

使用Phusion聚合酶以及nifH-b1-112F和nif H623R引物扩增部分nifH基因。热循环条件为98℃2分钟，然后以98℃10s，60℃30s和72℃20s进行35个循环，最后72℃5min延伸
。将扩增子克隆到pGEM T-easy载体 (Promega, San Luis
Obispo, CA)中，并通过Genewiz(South Plainfield, NJ)进行测序。

统计分析

Statistical analyses

使用单尾方差分析(ANOVA，Holm-Sidak方法，P<0.05)来(i)比较在指数期和稳定期中测得的Mo-Nase和V-Nase的R比的方差及来(ii)比较在同一天测得的仅用碳(+C)，碳和钼(+C+Mo)以及碳和钒 (+C+V) 处理过的土壤乙炔还原活性的方差。

编译：马腾飞 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

J.P. Bellenger, Y. Xu,X. Zhang,F.M.M. Morel,A.M.L. Kraepiel. Possible contribution of alternative nitrogenases to nitrogen fixation
by asymbiotic N2-fixing bacteria in soils.Soil Biology and Biochemistry 69 (2014) 413e420 https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2013.11.015

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