环境条件而非微生物接种物的组成决定了重建土壤微生物群落的细菌组成、微生物生物量和酶活性

Environmental conditions rather than microbial inoculum composition determine the bacterial composition, microbial biomass and enzymatic activity of reconstructed soil microbial communities

Impact Factor：5.290

https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2015.07.018

发表日期：2015-08-04

第一作者：Weibing Xun(荀卫兵)^a,b

通讯作者：Ruifu Zhang(张瑞福)(rfzhang@njau.edu.cn)^a,b

合作作者：Ting Huang,Jun Zhao,Wei Ran,Boren Wang,Qirong Shen

主要单位：

^a南京农业大学国家有机类肥料工程技术研究中心(National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers, Jiangsu Key Lab and Engineering Center for Solid Organic Waste Utilization,
Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, PR China)

^b中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业部微生物资源收集与保藏重点实验室(Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081, PR China)

写在前面

分享标题：SBB：重建土壤微生物群落的特性究竟由谁决定

关键字：γ射线灭菌，土壤培养，细菌群落，微生物生物量，酶活性

点评：时势造英雄，还是英雄造时势，作者开启灵活大胆的思维方式运用巧妙的实验构思设计，通过一番“玩泥巴”的骚操作严密谨慎全面的论证了“时势造英雄”的观点，使我们更进一步了解了土壤细菌群落产生和维持的机制，表明了土壤的pH值是影响重建新细菌群落的主导因素，最终得出土壤微生物群落的组成和功能主要取决于土壤性质，而不是微生物接种物的观点，实验设计新颖巧妙，VPA分析等结果说服力强，最后提出一“橄榄球”模型“画龙点睛”之笔深入浅出地说明了问题。

摘要

土壤中微生物群落的组成和酶活性的水平都是土壤质量的重要指标，但土壤细菌群落产生和维持的机制尚不完全清楚。我们从同一地点采集了两份土壤样品，但每一份都经过了不同的长期施肥处理，其微生物多样性、生物量和理化性质各不相同。我们将这些样品进行γ灭菌并交换接种。将未灭菌的土壤样品以及经过灭菌和接种的土壤样品孵育八个月，然后分析其营养成分，微生物生物量，酶活性和细菌组成。未灭菌土壤中的总磷和钾浓度以及总有机物含量均与已灭菌并自我/交换接种的同一土壤中的总磷，钾浓度相同。此外，微生物生物量碳浓度不受特定接种物的影响，仅受土壤类型的影响。与用有机肥和化肥改良土壤（NPKM）接种微生物的无菌土壤以及未灭菌土壤样品进行比较，用化肥改良土(NPK)接种微生物的无菌土中过氧化氢酶、转化酶、脲酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和植酸酶活性较低。454-焦磷酸测序法检测的细菌16S rRNA表明，尽管微生物接种物中细菌类群的丰度不同，土壤中的迁入微生物接种物重建的细菌群落组成主要由土壤理化性质的影响。例如，土壤的pH值是影响重建新细菌群落的主导因素。综上所述，这些结果表明，土壤微生物组成和功能主要取决于土壤性质，而不是微生物接种物，这有助于我们了解土壤微生物群落是如何产生和维持的。

背景

土壤中的生物活性主要取决于微生物支持的生态系统过程，这对于维持养分循环的强度和稳定性尤其重要。因此，确定微生物群落在土壤中产生和维持的机制对于理解其生物功能至关重要。

一般来说，通过人工运输或自然传播到达新环境的生物需要应对两个主要压力:环境改变和与当地生物群落的新的互动。细菌利用一系列的策略来适应它们的新环境，包括形态可塑性的发展，利用精氨酸脱氨酶系统来应对酸性环境，以及与吞噬细胞的相互作用来应对氧化应激。

一个世纪以前，微生物生物地理学是这样描述的:万物皆在，环境选择；然而，最近的一些想法对这一观点提出了挑战。当生物体面临不利的环境条件时，它们就会休眠。这些不利的环境条件，包括偏离最佳pH值、土壤养分不良、高温或低温、有毒物质等，都是生物体生存的挑战。了解这些挑战对原位微生物群落重建具有重要意义。

休眠的微生物产生一种微生物接种体，这种接种体将导致未来群落的多样性和动态变化。以前的研究已经解决了具有相同原始微生物群落的微生物群落组成的原位变化，但是将一种全新的微生物菌剂引入一个新的环境，特别是灭菌的环境，还没有得到很好的研究。

Nannipieri等人认为，每一种土壤都有自己的生物空间，因此在平衡条件下保持特定的微生物生物量值。土壤类型可能是维持细菌群落组成的决定因素，Griffiths等人建立了沙质和粘土质土壤的交换微生物群落，并报道了微生物群落的组成取决于土壤类型，而不是接种源。Delmont等证实了这一点，他们确定了在两种不同的无菌土壤中发现的细菌群落组成，这些土壤已经接种了来自同一土壤的未灭菌样品或未灭菌的外来土壤样品。但是，这些实验本质上是使用了具有不同母体材料和不同植被的不同土壤。此外，在这些重建的微生物群落中新的微生物活性还没有被检测，而这些信息可能为了解微生物多样性和微生物功能之间的关系提供了思路。

我们假设，不仅土壤细菌组成，而且土壤微生物功能主要是由土壤性质决定的，而不是由微生物接种物决定的。为了对此进行测试，我们使用了过去23年中相同来源但施肥管理不同的两个土壤样品。交换接种它们的微生物群落，并通过16S rRNA基因的条形码焦磷酸测序来确定重建的细菌群落的组成。采用实时荧光定量PCR法检测功能基因丰度。我们也评估了土壤酶活性、理化性质和微生物生物量。

材料与方法

土壤样品

Soil sampling

土壤样品采集自中国农业科学院红壤实验站，位于中国南部的湖南省祁阳(111530E,26450N)，海拔120米。这个站的土壤被称为铁铝始成土，它最初是由第四纪红色黏土发展而来的。施肥试验始于1990年，包括冬小麦和夏玉米的年度轮作。在随机区组设计中采用两次重复进行不同的施肥处理。2011年11月从两个施肥处理中采集土壤样本，即化学施肥(氮肥、磷肥、钾肥、NPK)和粪肥化肥联合施肥(NPKM)。每个处理的新鲜样本取自两个重复的地块(每个地块8个随机土芯)，并充分混合以供进一步研究。这两种土壤样本被暂时保存在一个便携的储存箱里，被运送到实验室后都经过一个2毫米的筛子。用于测量酶活性和理化性质的样本被风干，用于DNA提取的样本被保存于—80℃冰箱，其余的样品暂存于4℃，以备进一步研究使用。

微生物群落交换和培养

Microbial community swapping and incubating

将储存于4℃的土壤样品用γ射线(60 kGy)辐照灭菌后，将200克的无菌土壤放入500毫升的瓶中，室温静置8周。接下来，添加无菌水以保持恒定的水分含量（田间持水量的30％），样品在黑暗中20℃预培养2周后进行无菌检测。用已储存在4℃下的经NPK和NPKM处理的土壤样品制备微生物接种物，首先，土壤样本在20℃下置于定期充气的袋子中预培养两周。接下来，将20克土壤和20克玻璃珠(直径3-4毫米)放入180毫升无菌水中，摇匀20分钟。将20ml的土壤悬浮液与200g 经γ射线灭菌过的土壤混合，将经NPK处理土中的微生物接种到NPK组(自我接种对照，指定为NPKtoNPK)和NPKM组(指定为NPKtoNPKM)的灭菌土样品中。相反，将经NPKM处理土中的微生物接种到NPKM(自接种对照，指定为NPKMtoNPKM)和NPK(指定为NPKMtoNPK)两组的无菌土壤样品中。另外，将在4℃保存的200g未灭菌的NPK和NPKM土壤样品放入500 mL的无菌瓶中作为对照(分别命名为CKNPK和CKNPKM)。每个对照、自接种对照和交换接种处理各重复3次随机区组置于恒定湿度(田间容量的45％)、20 ℃条件下孵育8个月(2012.01-2012.08)。

土壤分析

Soil analysis

孵育八个月后，将土壤通过2毫米筛子，并进行了多次测量。采用PHS-3C mv/pH检测器(中国上海)测定土壤pH值，土壤水比为1:5，用碳酸氢钠提取有效P (AP) ，钼蓝法测定其浓度，用乙酸铵提取速效钾，火焰光度法测定速效K (AK)的浓度，总N (TN)测定采用凯氏消化法，用HFeHClO₄提取总P(TP)和总K(TK)，分别用钼蓝比色法和火焰光度法测定其浓度，土壤有机质(SOM)浓度测定采用重铬酸钾容量法，微生物生物量碳(MBC)浓度测定采用氯仿熏蒸-萃取法。

测定了6种土壤酶活性：(i)过氧化氢酶，采用高锰酸钾法;(ii)脲酶，用苯酚次氯酸钠比色法测定产铵量;(iii)转化酶，采用3,5 -二硝基水杨酸比色法;(iv)蛋白酶，采用Gareth Jiang方法;(v)酸性磷酸酶，用磷酸苯二钠比色法;(vi)植酸酶，采用植酸钠分解和氯化亚锡比色法。

细菌群落组成和功能基因丰度

Bacterial community composition and functional genes abundances

使用PowerSoil DNA提取试剂盒(Mo Bio Laboratories Inc.， Carlsbad, CA, USA)从1.0 g的土壤中提取DNA。每个样本的连续三次DNA的提取被汇集，利用NanoDrop ND- 1000分光光度计(NanoDrop, ND2000, ThermoScientific,
111 Wilmington, DE)测定的260/280 nm和260/230 nm的吸光度比来评价DNA的质量。

利用ABI 7500实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)进行实时荧光定量PCR，以SYBR green为荧光染料，测定功能基因的相对丰度，如氨单加氧酶(amoA)、硝酸还原酶(narG)、亚硝酸盐还原酶(nirK和nirS)、一氧化二氮还原酶(nosZ)和固氮酶(nifH)基因。所有的PCR反应都是先在95℃条件下进行5分钟的酶激活，然后进行40个循环，95℃条件下15秒，60℃条件下34秒，最后升温至95℃条件下15秒。扩增产物的特异性也得到了验证。

基于细菌16S rRNA的V1-V3高变区，采用正如Dethlefsen等人和Huse等人之前描述的PCR引物F27: 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-TC-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ and R533: 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-AC-NNNNNNNNNN-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’。每个融合引物包括Roche-454 A/B接头(以斜体显示)和一个2bp的linker sequence(以粗体显示)，然后是一个独特的纠错barcode sequence(Ns)和最后的16S rRNA引物。该引物扩增的区域非常适合用于细菌序列的精确系统发育分析。

随后，通过测序对每个土壤样本中的细菌群落进行了表征(454 GS-FLX Titanium System (Roche, Switzerland) by Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd (中国，上海))。焦磷酸测序数据遵循Schloss标准操作程序(SOP)使用Mothur处理(版本1.27.1)。

基于Mothur的PyroNoise算法的重新执行使用默认参数对包含最小流长360和最大流长450的那些序列进行降噪。降噪这些序列包括(i)与正向引物序列有两个以上不匹配或/和条形码序列有一个不匹配的序列，(ii)包含非指定标签的序列;（iii）包含任何模棱两可base calls(Ns)的序列，(iv)包含同聚物超过八个核苷酸的序列，或者(v)小于200个碱基的序列。

用独特的10-bp条形码对原始序列进行分类和区分。对条形码和引物序列进行裁剪，然后根据Silva数据库对所有唯一序列进行比对。通过筛选、过滤、预聚类、去除嵌合体和去除singleton序列，将定义为可用读长的保留序列构建距离矩阵，距离阈值为0.2。使用平均邻域算法，以97%的相似度为界，将所有序列聚类到可操作分类单元(OTUs)中。选择每个OTU中最丰富的序列作为代表序列，剩余的序列根据其OTU被分类到每个样本中。然后用RDP朴素贝叶斯rRNA分类器对代表性序列进行分类，置信限为0.6。如果一个OTU(具有一个以上的读长)只出现在一个样本中，并且在少于两个重复中被检测到，则将其移除。

统计分析

Statistical analyses

对于焦磷酸测序数据，每个分类的百分比被指定为相对丰度。采用去趋势对应分析(DCA)确定细菌群落的转化和整体功能变化，然后进行冗余分析（RDA），以确定影响其组成和结构的最重要的土壤变量。对于RDA，使用Mantel检验来检查群落结构与每个变量之间的相关性。只有通过Mantel检验确定为显著的变量(P < 0.05)被进行进一步的分析。MRPP用于比较有关环境变量的差异造成的群落并采用adonis检验不同因素对群落组成的影响。所有统计分析均采用R软件(version 3.0.1)中的Vegan包(v.2.0-8)。

结果

长期施肥对土壤性状有显著影响

Varying long-term fertilization had a significant effect on soil properties

尽管来自同一土壤，经过23年的不同施肥，我们在这项研究中收集的两个土壤样品具有明显不同的特征。NPKM土壤样品的pH和养分含量显著高于NPK (P < 0.001)。这表明，这两种土壤目前的细菌组成也有所不同，尽管这些细菌很可能在许多年前来自于同一个群落。

交换微生物接种物不会改变土壤性质

Swapping microbial inocula did not change the soil properties

在八个月的培育期后，各土样的理化性质(P < 0.001)(Table 1)和酶活性(P < 0.001)(Table 2)均存在显著差异。与CKNPK相比，NPKtoNPK或NPKMtoNPK样品的总磷(TP)、总钾(TK)、有机质(SOM)和微生物生物量碳(MBC)浓度变化不明显，土壤pH、有效氮(AN)、有效磷(AP)和有效钾(AK)存在显著差异(Table 1)。NPKM土壤样品表现出类似的方式情况。

表1. 对照组、自我接种组和交换接种组的土壤理化特性和微生物生物量碳浓度

Soil physicochemical characteristics and microbial biomass carbon concentrations of the controls, self inoculation and swap inoculation treatments

AN, 土壤速效氮；TN, 土壤总氮；AP, 土壤有效磷；TP, 土壤全磷；AK, 土壤有效钾；TK，土壤全钾;SOM, 土壤有机质;MBC，微生物生物量碳。

^a NPK土壤，
未灭菌NPK土壤(CKNPK)和接种悬浮液的灭菌NPK土壤(NPKtoNPK, 来自NPK处理的土悬液接种的灭菌NPK土;NPKMtoNPK,来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPK土)；NPKM土壤，未灭菌的NPKM土壤(CKNPKM)和接种悬液的灭菌NPKM土壤(NPKMtoNPKM, 来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPKM土；NPKtoNPKM, 来自NPK处理的土悬浮液接种的灭菌NPKM土)。

^b 数值显示NPK土与NPKM土有显著性差异(P < 0.001)。

^c 数值(平均值±标准差)表示各个土壤特性的绝对数量。根据 Duncan’s多重比较，栏中不同的字母(以粗体显示)表示相同土壤中的不同处理之间存在显着差异(P <0.05)。

表2. 对照组、自我接种组和交换接种组的6种酶活性

Six enzyme activities of the controls, self inoculation and swap inoculation treatments

^a NPK土壤，
未灭菌NPK土壤(CKNPK)和接种悬浮液的灭菌NPK土壤(NPKtoNPK, 来自NPK处理的土悬液接种的灭菌NPK土;NPKMtoNPK,来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPK土)；NPKM土壤，未灭菌的NPKM土壤(CKNPKM)和接种悬液的灭菌NPKM土壤(NPKMtoNPKM, 来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPKM土；NPKtoNPKM, 来自NPK处理的土悬浮液接种的灭菌NPKM土)。

^b 数值显示NPK土与NPKM土有显著性差异(P < 0.001)。

^c 数值(平均值±标准差)表示各个酶的绝对活性。根据 Duncan’s多重比较，栏中不同的字母(以粗体显示)表示相同土壤中的不同处理之间存在显着差异(P <0.05)。

微生物接种对功能基因丰度和酶活性影响不大

Microbial inocula had little impact on functional gene abundances and enzymatic activities

在各自处理条件下，基于实时PCR的N循环基因的定量分析(Fig. 1)表明，NPK和NPKM土壤之间存在显着差异，而相同土壤的处理之间差异较小。在NPKM土壤中，所有参与N循环的功能基因都显著增加。

图1. 各处理条件下氮循环基因的实时PCR定量分析

Six enzyme activities of the controls, self inoculation and swap inoculation treatments

星号()表示NPK土壤和NPKM土壤的基因丰度之间的显著性:P < 0.05， **P < 0.01。

与NPK土壤样品相比，NPKM土壤样品的酶活性水平更高(Table 2)。在NPK土壤样品中，CKNPK酶活性最高其次是NPKMtoNPK和NPKtoNPK。同样，在NPKM土壤样品中，CKNPKM酶活性最高，其次是NPKMtoNPKM和NPKtoNPKM。为了确定微生物的数量或质量在酶活性恢复中的作用，我们计算了酶活性与微生物生物量碳（EA / MBC）的比值(Table 3)，发现与每种土壤样品的其他两种处理相比，在CK条件下这一比值显着更高。

表 3 对照组、自我接种组和交换接种组中酶活性(EA)与微生物生物量碳(MBC)浓度的比值

Ratios of enzymatic activity (EA) to microbial biomass carbon (MBC) concentration under the controls, self inoculation and swap inoculation treatments

^a
未灭菌NPK土壤(CKNPK)和接种土悬液的灭菌NPK土壤(NPKtoNPK, 来自NPK处理的土悬液接种的灭菌NPK土;NPKMtoNPK,来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPK土)；未灭菌的NPKM土壤(CKNPKM)和接种土悬液的灭菌NPKM土壤(NPKMtoNPKM, 来自NPKM处理的土悬液接种的灭菌NPKM土；NPKtoNPKM, 来自NPK处理的土悬液接种的灭菌NPKM土)。

^b 数值(平均值±标准差)表示每个土壤特性的绝对数量。根据 Duncan’s多重比较，栏中不同的字母（以粗体显示）表示相同土壤中的不同处理之间存在显着差异（P <0.05）。

细菌群落组成受土壤环境的影响

Bacterial community composition was influenced by the soil environment

通过对16S rRNA基因进行条形码焦磷酸测序，确定每个样本中细菌群落的组成。序列的识别值为90，然后以97%相似度结合成操作分类单元(OTUs)。群落多样性和检测出的OTUs通过系统发育方法计算，而样本相似性通过系统发育和分类学方法计算。我们观察到NPK土壤样品的细菌群落在物种分类和OTU水平上与NPKM土壤样品有显著差异(Table 4)。MRPP和
adonis分析表明，NPK和NPKM土壤的细菌组成存在显著差异。Adonis分析还显示，NPKM的组成有显著差异，但NPK土壤样品中没有。

表4. 通过两种不同的统计方法评估对照、自接种和交换接种处理对总体微生物群落结构的影响，得到统计显著性检验结果

Statistical and significant test results for the effects of the controls, self inoculation and swap inoculation treatments on the overall microbial community structure assessed by two different statistical approaches

括号中的数字(以粗体显示)表示显著性(P 值)。

^a 物种分类学水平上微生物群落结构的比较。

^b系统发育水平上微生物群落结构的比较。

^cMulti-response permutation procedure。统计量是抽样单位之间成对差异的组内均值的总体加权均值。

^dPermutational multivariate analysis of variance。使用基于原始数据置换的顺序平方和的F检验进行显着性检验。

^e同一土壤处理后各处理间的比较。

^f不同土壤的比较。

在分类学水平(图. 2)，NPK土壤样品中物种组成比例下降最大的是Bacteroidetes，其次是Gemmatimonadetes、Verrucomicrobia和Nitrospirae。相比之下，比例增加最多的是Chloroflexi，其次是Firmicutes 和TM7。在OTU水平上，我们观察到NPKM土壤样品的丰富度指数(Chao和ACE)、多样性指数(Shannon和Simpson)和DOtuN均显著增大。此外，去趋势对应分析(DCA)(图. 3)通过DCA1可以分离两种土壤的群落(37.3%)，通过DCA2可以分离NPKM土壤的群落(7.7%)，而对于NPK土壤的群落是不可能的。通过对10个土壤变量的拟合，进行冗余分析(RDA)(图. 4)，结果表明微生物群落组成(r=0.756,P = 0.001)显著地受到土壤中几个关键的物理和化学变量的影响。根据pH、SOM、微生物生物量等主要变量，RDA1可以很好地分离NPKM和NPK土壤样品的细菌群落(36.8%)。

图2. 16S rRNA序列在所有处理条件下在细菌门水平中的分布。

Distribution of 16S rRNA sequences across bacterial phyla under all treatment conditions

图3. 以每个样本97%聚类OTUs的细菌群落去趋势对应分析(DCA)

Detrended correspondence analysis (DCA) of bacterial communities based on OTUs at a distance of 3% for individual samples

前两个成分分别为37.3%和7.7%。

图4. 冗余分析（RDA）在细菌群落中确定了9个选定的环境变量

Redundancy analysis (RDA) identified nine selected environmental variables among bacterial communities

为了确定土壤pH值、其他土壤特性(如养分含量和接种源)对细菌群落组成的相对贡献，我们进行了方差分解分析(VPA)，该分析试图将因变量的总方差划分为不同部分。为了评估土壤养分含量的影响，通过BioEnv程序选择一组特征参数(SOM、MBC、TN和TP)。这些变量解释了观察到的变化的51.6%，留下48.4%的变化无法解释(图. 5)。土壤pH值对观测到的变异的解释最多(23.7%，P= 0.002)，其次是其他土壤特征(12.9%，P= 0.021)，接种源对变异的解释非常少(4.2%，P= 0.075)。这些变量之间的相互作用也占观察到的变化的一部分，例如，土壤pH与其他土壤特性之间的相互作用占6.2％(P =0.031)，与接种物的相互作用解释了其他1.8+2.3+0.5=4.6%的变化。因此，土壤pH值、土壤特性以及两者之间的相互作用是解释土壤中细菌群落组成变化的重要因素。

图5. 利用方差分解分析法(VPA)确定了土壤pH为决定因素

(H)、接种源(I)、土壤特性(C)以及这些参数之间的相互作用对细菌群落结构的影响

Variation partitioning analysis (VPA) was used to determine the effects of soil pH (H), inocula sources (I), soil characteristics (C) and interactions between these parameters on the structure of the bacterial community

三角形边缘上的圆圈表示由每组因素单独解释变化的百分比。这些因素中的两个或三个之间的相互作用所解释的变化百分比是由边的矩形或三角形中间的圆来指定的。无法解释的变化被描绘成底部的长方形。

讨论

在本研究中，相同植被和气候的第四纪红粘土经过多年不同的施肥处理后，其土壤pH值、养分含量、微生物量、酶活性和微生物多样性均有所不同。培养8个月后，灭菌土和接种土的微生物量与对照土相当，这表明是土壤的性质而不是微生物的接种物在决定土壤微生物群的数量方面更为重要。这一观察结果似乎支持了Nannipieri等人的假设，即在平衡条件下，每一种土壤都有特定的生物含量。换句话说，总体含量是由于土壤微环境为土壤微生物群的生长提供了合适的条件。在微生境水平上，养分有效性、pH、土壤湿度、有机碳含量和植被类型可能影响微生物的组成。当细菌迁移到一个新的栖息地时，最关键的要求可能是在生存和建立一个新的群落之前的适应能力。

Dick等人报道了酶活性与土壤pH、土壤有机碳和总氮含量的正相关和负相关。在已灭菌和接种的土壤样品中进行的实验均表明，在影响整体酶活性方面，局部土壤特性比微生物接种更重要，因为除接受NPK接种的灭菌土壤外，已灭菌和未灭菌土壤的酶活性水平相同。这些结果表明，NPK接种物中存在的低pH和/或酶活性/合成抑制剂可能会减慢这些样品中酶活性的恢复。需要8个月以上的培育期来验证这一假设。

当存在合适的底物时，γ射线灭菌的土壤仍然表现出酶活性。各种酶已被证明能抵抗辐射，并且它们的位置被认为是造成这种抵抗的因素。一般来说，不同的酶对γ射线有不同的敏感性；因此，在60kGy的γ辐照土壤中，各酶的活性会有不同程度的变化。NPKM土壤样品的酶活性明显高于NPK样品。然而，只有三种EA/MBC比值在NPKM土壤中显著增大，说明这几种酶(蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶)的活性与微生物量成正比，而其他土壤酶(过氧化氢酶、转化酶、脲酶)在相对良好的土壤条件下则表现出更好的活性。结果表明，微生物数量对蛋白酶、酸性磷酸酶和植酸酶活性的恢复贡献较大，而微生物质量对过氧化氢酶、转化酶和脲酶活性的恢复贡献较大。在NPK和NPKM土壤中，CK样品的酶活性最高，其次是NPKMto和NPKto样品。有趣的是，对于NPK和NPKM土壤，在CK样品中EA / MBC比也最大，而在NPKto样品中EA / MBC比最小，这表明: (I)60 kGyγ辐射至少破坏了土壤中部分酶的活性；(II)这种活性在微生物群落重建过程中逐渐恢复到正常水平;(III)接种源对恢复程度有影响。

中性pH的土壤中细菌的丰富度和多样性较大，酸性土壤中细菌的丰富度和多样性较小。我们观察到NPKM土壤样品的丰富度指数(Chao和ACE)、多样性指数(Shannon和Simpson)和DOtuN均显著增大。这些土壤之间细菌多样性和丰富度的差异主要可以用土壤pH值和其他几个特征来解释(图. 5)。此外，微生物量只取决于培养条件。因此，NPKM土壤样品的细菌丰富度、多样性和微生物生物量显著增大，这是由于该土壤的酸性pH值和养分含量较大。

尽管在生产型生态系统中相对稀缺，休眠细菌在营养缺乏的系统中可能占分类学丰富度的40％。NPK和NPKM土壤中以Acidobacteria和Proteobacteria为主，而Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Verrucomicrobia和Nitrospirae在NPK土壤中比例下降，而Chloroflexi、Firmicutes和TM7在NPK土壤中比例上升。这些结果表明，随后被接种到NPKM土壤中的来自NPK处理土壤的接种物建立起了与来自CKNPKM土壤相似的群落，而被接种在到NPK土壤中的来自NPKM处理土壤的接种物建立了与CKNPK土壤相似的群落。因此，两个接种体似乎都包含具有几乎相同的生物分类组成（但丰度不同）的细菌群落，因为尽管施肥条件不同，它们还是从相同的群落中进化而来。有趣的是，根据MRPP、adonis和DCA分析，NPK土壤样品的细菌群落在细菌组成和相对丰度上没有显著差异，而根据adonis和DCA(而不是MRPP)分析，NPKM土壤样品的细菌群落有显著差异。这些土壤细菌群落的相似性在很大程度上与环境特征有关，而与地理邻近性无关，这说明这些细菌群落所遇到的环境特征越接近，它们的相似度越高。一般来说，功能基因表达与细菌群落组成有关;因此，在NPKM土壤样品中检测到更多的功能基因拷贝。

考虑到两个具有不同环境特征(如土壤pH值、养分含量、水分、有效碳等)的无菌土壤样品。当接菌物作为细菌接菌剂引入其中一种土壤时，由于土壤中有丰富的空间和养分，经过短暂的适应期后，细菌开始随机生长。然而，随着细菌的增殖，在单细胞水平上起作用的环境压力将会增强，直到细菌活性和环境压力最终达到动态平衡。

基于这些环境特征的限制，利用细菌群落的非度量多维尺度，我们构建了一个模型来描述不同环境条件下细菌群落发展的最终状态。首先，细菌群落在pH值相同的土壤中生长(图. 6a)。细菌接种物(A点)接种到土壤样品中，在那里他们发现一个潜在的发展空间(空间B)，这允许建立几种类型的细菌群落。潜在的发展方向被随机决定(DD1、DD2、DD3、DD4 DDi)。然而，不同土壤样品的半径并不相同，例如，酸化(或碱化)土壤会限制细菌群落的发展。VPA分析表明，土壤特征是细菌数量的良好预测因子。已有研究表明，土壤水分、土壤有机碳和土壤C/N可能影响细菌群落。其次，当考虑土壤pH值时(图. 6b)，模型看起来像橄榄球。在中部是中性土壤，细菌接种物有较大的发育空间，因此能够在不同的土壤组成之间构建更多种类的稳定群落。

图6. 描述不同环境条件下细菌群落潜在发展的模型

A model used to describe the potential development of bacterial communities under different environmental conditions

(a) 相同pH值时土壤细菌群落的发展。点A为细菌接种点，空间B为细菌群落发育的土壤环境。DD1、DD2、DD3、DD4……DDi是潜在的发展方向。R是每个土样的发展半径。

(b) 土壤pH值的影响(从酸性到碱性)。横截面与(a)中描述的条件相同。

结论

本研究表明，土壤微生物群落的细菌组成、微生物生物量和酶活性主要取决于土壤性质，而不是取决于接种的微生物。在被研究的土壤性质中，pH是影响重建新细菌群落的主导因子。这一结果支持Griffiths和Delmont等人的发现。与灭菌土壤相比，非灭菌土壤中过氧化氢酶、转化酶、脲酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶的活性更高，分别对于NPK和NPKM土壤，当与NPKto样品比较时，NPKMto样品的这些酶活性更高。当NPK处理的土被用作接种剂时可能存在生物恢复不完全的问题。此外，NPKM土壤样品含有更多的功能基因拷贝。因此，我们得出结论，土壤微生物功能主要由土壤特性决定，细菌群落组成也是如此。

编译：马腾飞 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Weibing Xun, Ting Huang, Jun Zhao,  Wei Ran,Boren Wang,Qirong Shen,Ruifu Zhang. Environmental conditions rather than microbial inoculum
composition determine the bacterial composition, microbial biomass and enzymatic activity of reconstructed soil microbial communities.Soil Biology and Biochemistry 90 (2015) 10e18 doi:https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2015.07.018

一作简介：荀卫兵，南京农业大学90后副教授，以下两篇为其近期一作发表的文章。

Nature子刊：南农沈其荣、张瑞福团队揭示多样性激发的确定性细菌装配过程限制群落功能

Microbiome：南农张瑞福团队揭示放牧引起草原微生物组变化驱动土壤有机碳的转化和生产力的提升

猜你喜欢

• 10000+: 菌群分析
  宝宝与猫狗 提DNA发Nature 实验分析谁对结果影响大  Cell微生物专刊 肠道指挥大脑
• 系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组
• 专业技能：生信宝典 学术图表 高分文章 不可或缺的人
• 一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树
• 必备技能：提问 搜索  Endnote
• 文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical
• 扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图
• 16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun
• 在线工具：16S预测培养基 生信绘图
• 科研经验：云笔记  云协作 公众号
• 编程模板: Shell  R Perl
• 生物科普: 肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘  

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

点击阅读原文，跳转最新文章目录阅读
https://mp.weixin.qq.com/s/5jQspEvH5_4Xmart22gjMA