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土壤微生物群落对有机/无机土壤改良剂和细菌入侵的恢复力

Resilience of the resident soil microbiome to organic and inorganic amendment disturbances and to temporary bacterial invasion

翻译：葛安辉 中科院生态环境中心

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

Microbiome, [9.133]

DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-018-0525-1

Published: 13 August 2018

作者：Késia Silva Lourenço^1,2,3, Afnan K. A. Suleiman¹, A. Pijl¹, J. A. van Veen^1,3, H. Cantarella² and E. E. Kuramae^1*

1. 荷兰，瓦赫宁根，荷兰生态所(NIOO)，微生物生态中心
2. 巴西，坎皮纳斯农艺研究所(IAC)，土壤与环境资源中心
3. 荷兰，莱顿大学，莱顿生物所

通讯作者：E. E. Kuramae E.Kuramae@nioo.knaw.nl

摘要

背景

蔗渣是甘蔗生产乙醇的副产品，由于其营养成分丰富，常被甘蔗种植园作为肥料回收利用。然而，蔗渣的化学和微生物组成对土壤微生物群落动力学的影响尚不清楚。本文评估了在甘蔗生长季(389天)内，有机蔗渣、无机氮或两者的组合应用引起的多次扰动后，土著土壤微生物群落的恢复情况。此外，我们还评估了土壤微生物群落对蔗渣微生物群落的抗性。

结果

单独施用蔗渣或施氮前30天施用蔗渣可导致土壤微生物群落发生相似的变化。此外，蔗渣与氮肥联合施用对土壤微生物群落的影响与单独施用氮肥不同。有机蔗渣是微生物、营养物质和有机质的来源，这些因素的组合驱动了土壤微生物群落的变化。然而，由于土壤群落的恢复能力，这些变化仅限于很短的一段时间。蔗渣微生物群落中的入侵细菌在土壤条件下无法生存，并在31天后消失，只有醋酸杆菌科(土著)和乳酸菌科能够在土壤中存活。

结论

本文结果表明，土著土壤微生物群落对蔗渣和无机氮的施用具有较低的抵抗力，但具有很强的恢复力。

研究背景

使用不同的原料(如甘蔗、甜菜、玉米)生产生物乙醇产生的大量有机残留物，可以作为有机肥料循环利用。蔗渣是甘蔗生产乙醇的副产品。巴西是目前最大的甘蔗乙醇生产国(每年6.591亿吨甘蔗)，每生产1升酒精就会产生约10-15升的蔗渣(每年275亿升乙醇和大约3600亿升的蔗渣)。蔗渣通常是一种酸性堆肥(pH3.5-5)，呈深棕色，有机含量高(化学需氧量50–150g/L)。为了避免排放到河流中，人们尝试了很多蔗渣利用方法，包括作为肥料直接施用于甘蔗种植园，作为主要的钾、有机质、氮和磷的来源。由于钾的含量很高，将蔗渣作为有机肥施用并不能满足植物所需的总氮量。因此，在巴西的甘蔗园中，蔗渣常与矿质氮肥混合使用。由于蔗渣的高含水量和有机含量，无机和有机肥料的联合施用大大增加了向大气排放的温室气体，特别是一氧化二氮(N₂O)和二氧化碳(CO₂)。

通常认为有机肥料比无机肥料更环保，因为有机肥料可以循环利用农业系统中产生的养分，改善土壤质量。然而，有机残留物的应用可能会破坏土壤微生物群落。已有报道研究无机肥料对土壤微生物群落结构的短期和长期影响。然而，很少有研究评估有机肥对土壤细菌群落的影响，特别是在施用后和整个植物生长季。有机肥料由于其含水量、化学和有机成分以及外源微生物的引入(取决于原料来源)，直接或间接地对土壤生境造成小规模的扰动。土壤微生物群落通常对外源微生物具有抗性和/或弹性，并恢复到原来的状态。以往对甘蔗的研究表明，蔗渣和矿质氮肥的联合施用可以改变特定的细菌群，有利于CO₂-C和N₂O-N的高排放。当选择在N肥施用前或N肥施用后添加蔗渣时，N₂O和CO₂排放量与联合施用相比减少，但对微生物群落的影响尚不清楚。此外，没有研究考虑过蔗渣施用后土壤微生物群落随时间的动态变化，以及蔗渣对土壤微生物群落恢复能力的影响，也没有研究过蔗渣微生物对土壤微生物群落的潜在入侵。

扰动通常根据其持续时间和对土壤理化性质的直接或间接影响分为脉冲或压力(pulse or press)。一般来说，有机和无机肥料的添加是脉冲扰动，它们是相对离散的短期事件；而压力扰动是长期的或连续的，如石灰或淹水改变土壤pH。土壤微生物可能表现出对扰动的抵抗力或恢复力，如果它们表现出敏感性，不同微生物可能有不同的响应，或表现出功能冗余。抵抗力定义为群落对扰动不敏感的程度，恢复力是群落在受到扰动后恢复到原有组成的现象。最后，功能冗余是指即使群落组成是敏感的、不具有恢复力或抵抗力，其功能仍然与原始群落相似。微生物群落的功能冗余与群落中功能冗余物种的存在有关。因此，由于扰动、持续时间和微生物群落的稳定性，群落的响应可能有很大的不同。鉴于维持土壤功能的极端重要性，必须阐明土壤生态系统对扰动(有机和无机肥料和季节性)的响应。

在本研究中，我们评估了(i)在整个甘蔗生长季节有机蔗渣、无机氮或两者同时施用引起的多次脉冲扰动(图1)，以及(ii)蔗渣微生物群落引入后，土著土壤微生物群落的恢复情况和蔗渣微生物在土壤中的残留。本试验采用巴西甘蔗种植管理方式，在田间条件下(覆盖旱季和雨季)进行了389天的试验。本研究采用16S rRNA基因扩增子测序技术，评估在施用蔗渣、矿质N或联合施用后，土壤微生物群落随时间与季节效应的变化。具体来说，连续多次扰动为蔗渣的应用，为第一次扰动；30天后添加矿物N，为第二次扰动。我们对16S rRNA基因序列进行了全面的分析，揭示了蔗渣与无机氮同时施用与施氮前30天添加蔗渣后，土壤微生物群落发生了相似的变化。此外，我们还发现，土壤微生物群落对有机和无机肥料的响应比全年季节性温度和降雨量的波动更强。蔗渣的应用引入了外源微生物，这些微生物大多无法在土壤条件下存活。土壤微生物群落对蔗渣和无机氮的施用具有较低的抵抗力，但具有很强的恢复力(图1)。

图1 矿质肥料和蔗渣的施用时间及本研究的主要结果

图1 矿质肥料(N:硝酸铵)和蔗渣的施用时间(a和b)及本研究的主要结果(c)。处理如下：V_f,第0天施用蔗渣；N,第0天施用无机肥硝酸铵；V_f|N,第0天施用蔗渣并在第30天施用无机肥硝酸铵；V_s+N,仅在第30天施用蔗渣和硝酸铵. 黑点代表不同的采样时间点,箭头的颜色代表不同的处理：N,黑色；V_f,蓝色；V_f|N,绿色；V_s+N,红色

研究结果

土壤微生物多样性及组成

Soil microbial diversity and composition

各处理与时间对Chao1指数无影响。在第1和31天，应用蔗渣(V_f)对土壤的α多样性没有影响。然而，在36和42天(矿质N施肥5和11天后)，蔗渣和氮肥同时施用的两个处理(V_f│N和V_s+N)土壤微生物α多样性高于氮肥或蔗渣单独(V_f)的处理(辛普森和香农指数)。然而，在113天后(代表雨季)，处理和季节气候变化均未对土壤微生物多样性产生影响。

基于16S rRNA基因序列，细菌(97.35%)的丰度在处理和时间序列上始终显著高于古菌(2.65%)。具体地，鉴定出了29个细菌门,包括8个主要门:变形菌门(28.0%±3.5)，酸杆菌门(19.0%±3.4)，放线菌门(15.9%±3.0)，绿弯菌门(12.5%±2.8)，浮霉菌门(6.2%±1.74)，疣微菌门(4.9%±1.2)，芽单胞菌门(3.0%±0.8)和拟杆菌门(2.9%±1.0)。其他细菌门的丰度小于7.6%。主要的土壤古菌门是泉古菌门(2.6%±1.3)。

多次脉冲扰动在时间序列上对土壤微生物群落的影响

Impact of multiple pulse disturbances on the soil microbial community over time

基于Bray-Curtis差异的PCoA分析发现，土壤微生物β多样性在试验过程中发生了变化。实验经过36天(矿质N和V_s应用5天) 后，土壤微生物群落在蔗渣和氮肥同时施用的两个处理(V_f│N和V_s+N)不同于那些只有蔗渣第0天(V_f)或只有氮肥第30天的处理。这些变化解释了α多样性分析中的差异。施肥效应解释了V_f蔗渣施用后50天群落结构的变化。每次取样时，处理间的差异持续减小，113天后微生物群落最终趋于相似，说明细菌群落在1年的时间尺度上具有长期的稳定性。处理、时间及其相互作用驱动土壤微生物群落组成，pseudo-F值分别为2.21,1.95和1.61(P≤0.04)。

为了进一步探索不同处理数据中的时间标志，我们使用了多元回归树(MRT)的方法。MRT分析的PCoA排序显示，微生物群落动态呈现周期性(图2)，除V_f│N扰动外，其他处理在扰动后回到大约相似的组成(图2c)。

图2 蔗渣和氮肥施用后微生物群落组成动态

图2 蔗渣和氮肥施用后微生物群落组成动态. 采用多元回归树(MRT)的分析方法独立计算各处理中时间对细菌群落结构的影响. 根据微生物的丰度和组成分别定义6个(a,d)和7个(b,c)不同颜色的圆圈. 圆圈内的群落组成用主坐标分析(PCoA)图表示,小点代表样品,大点代表处理的均值(在圆圈内). 背景中的灰色条形图代表细菌科，其丰度解释了PCoA图的变化. 处理如下：a V_f,第0天施用蔗渣；b N,第0天施用无机肥硝酸铵；c V_f|N,第0天施用蔗渣并在第30天施用无机肥硝酸铵；d V_s+N,仅在第30天施用蔗渣和硝酸铵

与非生物因素有关的类群

Taxa associated with abiotic factors

为了探究在不同处理间有差异的微生物类群，我们选择微生物多样性和差异性最高的天数(第36和42天)，在科水平上鉴定了分类生物标志物。基于线性判别分析效应(LEfSe)，在土壤中丰度最高的科主要在蔗渣有关的处理中(V_f│N和V_s+N)。排在前五位的生物标志物分别为：36天的醋酸杆菌科、乳酸菌科、盖氏菌科、FFCH4570、微球菌科和42天的Dolo_23、微球菌科、伯克霍尔德菌科、乳酸菌科和草酸杆菌科。

气候条件，土壤分析和二氧化碳排放

Weather conditions, soil analysis, and CO₂ emissions

试验期间平均气温为21.96°C,空气温度最小值和最大值分别为3.4和39.1°C。在研究的389天中，累积降水量约为1064毫米(7月14日至8月15日)。在取样日，充水孔隙空间平均为66%(范围为60 ~ 94%)。随着时间的推移，不同处理的pH值是相似的。

蔗渣处理后，通过二氧化碳测定的微生物活性较高。然而，二氧化碳排放量最高处理为蔗渣+N(V_s+N)，在其应用当天接近18 g C m^-2d^-1。氮肥处理的二氧化碳排放量最低。然而，随着时间的推移，在降雨和温度升高后，二氧化碳的排放量也在增加。干旱期(第0和389天)微生物活性低于雨季(第113和183天)。

在所有的环境因素、天气条件、土壤特征和养分有效性中，土壤水分是解释土壤微生物群落变化的最主要因素(图3; pseudo-F=4.7,P=0.002)。高土壤水分、低铵态氮解释了约21.7%的微生物群落变异(轴1,18.70%；轴2,1.91%)，说明未测定的生物或非生物因子解释了其余 78.3%的变异。

图3 环境因子和微生物群落的冗余分析

图3 基于所有处理的环境因子和微生物群落的冗余分析. 处理如下：V_f,第0天施用蔗渣；N,第0天施用无机肥硝酸铵；V_f|N,第0天施用蔗渣并在第30天施用无机肥硝酸铵；V_s+N,仅在第30天施用蔗渣和硝酸铵

蔗渣微生物群落对土壤微生物群落的影响

Effect of the vinasse microbiome on the soil microbial community

由于本研究中使用的两种蔗渣来自同一糖厂的不同批次，我们对V_f和V_s蔗渣的微生物群落组成进行了评估，确定了蔗渣施用后蔗渣微生物对土壤土著群落的动态影响。然后我们通过V_f处理追踪了蔗渣外源微生物。

蔗渣中存在主要细菌是属于壁厚菌门(93.5%±4.1)的韦荣氏菌科、乳杆菌科和优杆菌科(Eubacteriaceae)，放线菌门(3.8%±3.6)的双歧杆菌科和科里杆菌科(Coriobacteriaceae)，拟杆菌门(2.1%±0.9)的普雷沃氏菌科以及变形菌门(0.4%±0.3)的醋杆菌科。尽管有相似的微生物多样性，V_s蔗渣主要由单一的细菌科组成。V_f和V_s的主要区别是V_f中主要是韦荣氏菌科(Veillonellaceae)的聚球菌(Megasphaera, 79.3%±2.1); 而V_s主要是乳杆菌科的乳酸菌(96.5%±0.4): 这两个科都属于厚壁菌门。在蔗渣样品中没有发现古菌序列。为了评估蔗渣微生物施用后土壤细菌群落的变化、动态和恢复力，在12个时间点取样，包括不施肥的土壤样品。

蔗渣在土壤中的施用改变了土壤微生物群落(图2a)。然而，由于在蔗渣中发现的入侵性细菌造成了高分散性(PERMDISP P = 0.04)，因此这种群落组成的差异无法用PERMANOVA来评估。解决这个问题的方法是去除蔗渣来源的序列，并重新对OTU表进行规范化。采用PERMANOVA和ANOSIM验证了蔗渣对土壤微生物群落的影响，pseudo-F值和R值分别为1.48(P<0.04)和0.20(P=0.00)。根据1天后的Bray-Curtis差异，添加了蔗渣的土壤微生物群落与未添加蔗渣的土壤微生物群落(也被认为是第0天)存在差异。在第8天之前，差异在每个采样时间点持续增加，从第0天到第31天之间也存在差异。最后，经过36天后，微生物群落恢复到原来的状态，并保持稳定，直到第76天。随后由于降水事件频繁，温度和土壤湿度的升高，土壤微生物群落也发生变化。

为了更清楚地跟踪一年中微生物群落组成随时间变化的情况，我们使用了MRT方法(图2a)。与Bray-Curtis的结果一致，微生物群落随着时间的推移发生了变化，表现出恢复力。蔗渣施用解释了最高的群落变异(R²=0.303)。基于MRT的PCoA排序(图2a)显示微生物群落动态呈现周期性，36天后恢复到与第0天基本相同的组成。为了确定一年内观察到的变化是否由蔗渣外源微生物驱动，在去除所有在蔗渣中存在的微生物序列后，再次进行MRT分析，也得到了类似的结果。

LEfSe分析结果表明，蔗渣在土壤中应用后，乳酸菌科、普雷沃氏菌科、韦荣氏菌科、微球菌科、生丝微菌科、芽胞杆菌科、硝化螺旋菌科等的相对丰度发生显著变化。蔗渣中的外源微生物随后在土壤样品中被追踪。主要外源细菌类群消失或到31天后恢复原状(图4)。在第3天，蔗渣中发现的所有细菌的丰度最高。其中乳杆菌科、韦荣氏菌科和普雷沃氏菌科的丰度最高；然而，这些类群从266、391和328个OTU减少到第36天少于7个OTU。但是，183天之后乳酸菌科的相对丰度增加了。

图4 施用蔗渣后土壤中蔗渣细菌科的相对丰度

通过RDA分析只添加蔗渣(V_f)的处理，结果表明硝态氮浓度(NO₃^--N)是解释土壤微生物群落变化主要的环境变量。硝态氮浓度解释了约36.6%的微生物群落变异。

图4 施用蔗渣后土壤中蔗渣细菌科的相对丰度. 3个重复中门(p:)和科(f:)的相对丰度取ln值. 不同字母表示通过Tukey HSD检验的显著性差异(Tukey,p≤0.05)

讨论

在本研究中，土壤微生物群落具有很强的恢复力，但对单独施用蔗渣或与氮肥联合施用所引起的扰动不具有抵抗能力。蔗渣是一种富含有机C，有机N，钾和外源微生物的有机残留物，当施用于土壤时，可提高土壤的pH值、阳离子交换能力(CEC)、养分利用率和保水能力，改良土壤结构。由于蔗渣添加对土壤化学性质的影响，增加了具有富营养生活方式的土壤微生物丰度和活性。本文的研究表明，应用蔗渣主要增加了芽孢杆菌科、微球菌科(放线菌)、丝微菌科和硝化螺菌科的丰度。芽孢杆菌科被认为主要是好氧或兼性厌氧的异养菌，它们对可用的有机C(如蔗渣中的有机C)有较快的响应，而放线菌门被认为适应于营养丰富的土壤。令人惊讶的是，α-变形杆菌纲的生丝微菌科和硝化螺菌门的硝化螺菌科在蔗渣处理后的土壤中增加最多。许多生丝微菌科是低碳和化学异养菌，只有在碳源浓度较低的情况下才能生长，不能在营养丰富的培养基中生长。然而，这些生物能够利用硝态氮作为氮源。相比之下，硝化螺菌科具有高度的生理多样性，包括化能无机自养的好氧硝酸盐氧化细菌，它们可以利用蔗渣和秸秆矿化过程中的N。因此，从蔗渣中输入的氮可能解释了生丝微菌科和硝化螺菌科丰度增加。

单独或联合施用蔗渣和氮肥对土壤微生物群落有不同的影响。然而，蔗渣和无机氮在同一天施用(V_s+N)或在30天前施氮(V_f│N)导致微生物群落出现相似的变化。蔗渣的初始扰动对土壤微生物的稳定性有一定的影响。因此，已经受到胁迫的微生物群落更容易受到N添加后第二次扰动的影响。显然，V_f和N的施用之间的时间不足以使蔗渣产生显著的C分解和N矿化。有机C存在30天后及以后施用氮肥可降低碳氮比，促进微生物生长。但土壤微生物群落具有一定的恢复能力，76天后两个群落之间的差异减小。4个月后，各处理土壤群落基本一致。31天后，除醋酸杆菌科(土著菌)和乳酸菌科外，土壤中未检出蔗渣外源微生物。Pitombo et al. 也观察到，在蔗渣处理后，乳酸菌科的丰度有所增加，但在处理14天后其相对丰度降低，与无蔗渣处理相似。然而，作者只是在很短的时间内对微生物群落进行了评估(46天)。虽然在蔗渣应用(V_f)36天后，土壤微生物群落具有恢复力并恢复到到原始状态，但是仍观察到乳杆菌科在雨季(第113和183天)的相对丰度在所有蔗渣和施氮处理中(V_f,V_f│N,V_s+N)增加，并持续1年。乳酸菌一般耐受氧气或厌氧，出现在富含碳水化合物底物的生境中，是甘蔗生物乙醇生产的主要污染物。值得注意的是，试验区以前没有使用过蔗渣。在整个试验过程中，覆盖在土壤上的稻草很可能起到了作用：乳酸菌的存活是由于可利用的不稳定的有机C(秸秆矿化)的增加及较高含水率(秸秆还田)。本研究首次揭示了入侵蔗渣外源细菌在土壤中的持久性，进一步阐明了入侵蔗渣外源细菌在土壤中的固留对土壤生态功能是必要的。

土壤微生物群落的变化在所有处理中都是周期性的，但是从蔗渣和矿质氮的扰动中恢复后微生物群落与施用前有较小的变化。因此，土壤微生物群落对有机和无机肥料的响应比季节温度变化和全年降水量的波动更敏感。在实验一开始时大量覆盖在土壤表面的甘蔗秸秆(16Mg/ha)可能减缓了土壤失水速度，降低了土壤温度变化。这种屏障效应可能是旱季和雨季土壤微生物群落差异较小的原因(旱季:第0天和第389天；雨季:第183天)。

蔗渣和蔗渣外源微生物对土壤群落影响的结果的解释受到方法上的限制。首先，在土壤中发现蔗渣中存在的外源微生物，被认为是入侵细菌。根据定义，入侵微生物是指在观察时间点之前不属于原土壤中的微生物。我们没有使用特定的引物或标记蔗渣外源微生物来追踪其在土壤中的变化。我们使用了16S rRNA基因对蔗渣和土壤样本的微生物进行测序。除醋酸杆菌科和乳酸菌科外，蔗渣施用前土壤中未检出蔗渣微生物。这两个类群平均观察到的序列数分别为142和2，两条序列的观察结果可能是测序过程中的错误。其次，OTU数据是合成的，因为组成数据的结构相互依赖，去除OTUs并不能消除它们对其他OTUs的影响。这种依赖性可以解释为什么在去除蔗渣群落中发现的细菌后，土壤群落多样性没有明显差异。去除序列是从16S rRNA基因数据中去除真核或古菌序列的常见做法。删除序列会在剩余数据中产生偏差；然而，同样的偏差可能会出现在所有的采样样品中，因此样本比较应该是有效的。Tromas等人使用了类似的方法来预测湖泊中的蓝藻爆发。

结论

综上所述，本研究揭示了在甘蔗生长周期内，土壤细菌群落动态对有机肥和/或无机肥料施用的响应。有机蔗渣肥是微生物群落结构变化的主要驱动因素，土壤土著群落对蔗渣的施用抵抗力较低，但具有较强的恢复力。在蔗渣微生物组中发现的入侵细菌在土壤条件下无法生存，31天后消失，只有醋酸杆菌科(土著微生物)和乳酸菌科能够存活。

方法概要

本试验在巴西皮拉西卡巴市保利斯塔农业综合技术署(APTA)种植甘蔗品种RB86-7515的试验田中进行。供试土壤被划分为氧化土。实验为随机区组设计，共4个处理，每个处理3个重复，共12个小区。在每个地块上，种植了4行长为8米、间隔1.5米的甘蔗。处理如下：(1)V_f:第0天应用蔗渣;(2)N:第30天施用无机肥料硝酸铵;(3)V_f│N:第0天施用蔗渣并在第30天施用硝酸铵;(4)V_s+N:蔗渣+硝酸铵只在第30天施用。

氮肥施用量为每公顷100公斤硝酸铵。100立方米每公顷的蔗渣(V_f和V_s)喷洒在整个实验场地。由于蔗渣中含有无机氮和有机氮，因此蔗渣处理比无机氮处理具有更高的氮输入量。土壤样品(每块地6个采样点，每块地中央两行甘蔗各3个点)分别在第一次应用蔗渣(V_f)后的1、31、36、42、50、76、113、183和389天的9个时间点获得。为了评估蔗渣的效果和潜在的微生物入侵，在之前提到的9个时间点上又增加了2个时间点(第3天和第8天)。

16S rRNA基因扩增采用引物515F/806R扩增V4区，序列经过质控后进行下游分析。利用QIIME分析样品的α和β多样性。采用非参数多元方差分析(permutational analysis of variance , PERMANOVA) 和相似性分析(ANOSIM)检验处理、时间及其相互作用之间的群落结构差异。多元回归树(MTR)分析并确定最能解释每个处理中微生物群落组成差异的时间，RDA使用CANOCO软件分析。

参考文献

Lourenço K S, Suleiman A K A, Pijl A, et al. Resilience of the resident soil microbiome to organic and inorganic amendment disturbances and to temporary bacterial invasion[J]. Microbiome, 2018, 6(1): 142.

译者简介

葛安辉，中科院生态中心土壤分子生态学课题组博士研究生，2016年毕业于山东大学环境科学专业。目前主要研究方向是微生物对土传病害的调控机制以及叶际功能微生物与宿主的互作。在扩增子分析、培养组学、土壤生态过程等方法上有较多的积累。

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