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肠道内微生物合作方式的探究

撰文：冯雨彤 浙江中医药大学

责编：刘永鑫 中国科学院遗传与发育生物学研究所

写在前面

2016年4月25日在Nature杂志发表了一则文章，展示了肠道菌群合作的内部关系。此文采用实验验证了细菌-人类肠道中主要革兰氏阴性菌内部进化的协同作用，并以它为例揭示了合作表型在哺乳动物肠道微生物中的复杂性和重要性。

对于肠道菌群的研究目前十分热门，微生物与人类的健康、心情、体重等有着密不可分的关系。在肠道内，菌群大多数情况下，与人类社会一样，并非进行单一工作，而是相互合作、相互影响。

在许多情况下，合作表型被认为是微生物群落功能的核心，包括通过群体感应、生物膜形成、抗生素耐药性和发病机制进行沟通。人类肠道内有密集多样的微生物群落，对健康至关重要。然而，我们对这一重要生态系统内的合作知之甚少。

以下为对文章研究思路与研究结果的解读：

首先，作者选取重点放在细菌中人类肠道内部最丰富的革兰氏阴性菌，并以10种高丰度菌共同定植宿主，以此来检验哺乳动物微生物组内部合作的进化。

对宿主相关微生物的研究面临的一个主要挑战是了解形成这些群落的生态和进化动态。微生物动态的一个关键决定因素是种群内部和种群之间的合作和竞争的平衡。

细胞外消化被认为是细菌在多糖上生长所必需的一大重要条件。其中这类成员利用外表面糖苷水解酶将细胞外的多糖分解，其中一些分泌在外膜囊泡上。因此将重点转移至对这种菌群的基因改造。主要改造了BT 3698和BT 1760基因。分别用于支链淀粉和果聚糖的生长。下图为改造该位点基因的原因。

图1. 表面糖苷水解酶(GH)消化多糖的直接和协同效应。

a, 支链淀粉和左旋支链淀粉B.thetaiotoomicron（Bt）多糖利用位点及其产物或性质，每个基因编码如上所示并进行颜色分类。SPI或SPII代表信号肽酶I或II剪切位点。

b, c, 支链淀粉培养基中Bt WT和表面生长激素突变体的生长（n=2，细胞培养-生物学重复）(b)或Levan（n=2，细胞培养生物学重复）

d, e, 和表面生长激素突变体在支链淀粉单和共培养基中的生长（n=2，细胞培养生物学重复）(d)或Levan（n=2，细胞培养生物学重复）

在所有子图中，误差线代表标准误差；P值来自双尾学生t检验。

热心肠研究院

https://www.mr-gut.cn/papers/read/1091873576

Nature：肠道菌群是如何进行内部合作的？

创作：沈志勋 审核：蓝灿辉 2017年01月01日

①肠道菌群的内部合作对其生态系统十分重要；

②本文研究拟杆菌目内部合作的进化；

③多型拟杆菌在某种食物多糖中生长时只有有限的合作；

④相比之下，肠道共生的卵形拟杆菌中在多糖中生长时，存在着一种专业的交互共生酶系统；

⑤卵形拟杆菌胞外消化菊粉后的产物可供普通拟杆菌利用。

摘要

在许多情况下，合作表型被认为是微生物群落功能的核心，包括通过群体感应、生物膜形成、抗生素耐药性和发病机制进行沟通。人类肠道内有密集多样的微生物群落，对健康至关重要。然而，我们对这一重要生态系统内的合作知之甚少。在这里，我们实验测试了细菌-人类肠道的主要革兰氏阴性菌-内进化的协同作用。我们发现，在某些膳食多糖的生长过程中，模型成员拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)只有有限的合作。虽然这种生物可以从细胞外消化这些多糖，但缺乏这种能力的突变体更有竞争优势。相比之下，我们发现了一个特殊的交叉饲喂酶系统在肠道共生中占主流。卵拟杆菌（Bacteroides ovatus）它消化多糖的代价是自己付出代价，但对另一个物种却有好处。使用离体系统和小鼠定植模型，我们发现细胞外消化菊粉增加了适应度。卵拟杆菌（B. ovatus）在喂食其他肠道物种时所带来的互惠利益，例如：外阴拟杆菌（Bacteroides vulgatus），是微生物物种间自然进化合作的一个罕见的例子。我们的研究揭示了合作表型在哺乳动物肠道微生物中的复杂性和重要性。

背景

之前发现人类肠道微生物组细菌内存在不同形式协同作用的证据。并且已经发现了在微生物组中强有力的生态进化相互作用的证据，它们可能是这些复杂群落功能和稳定的核心。

了解微生物群落是否正式合作对于预测它们的进化和生态稳定性至关重要。虽然合作系统是有生产力的，但它们在生态和进化的时间尺度上都容易发生不稳定，从而破坏群落结构。一个物种利用另一个物种产生的废物的能力是普遍存在的，但仅仅产生废物并不意味着合作进化。相对于浪费产品的使用或开发的交互作用，之前很少有详细记录的微生物物种间进化合作的案例。

进化生物学中的一个关键问题是协作系统如何在进化上稳定。如果某些细胞投资于生产一种能帮助其他细胞的酶，那么是什么阻止这些细胞被消耗分解产物而不制造酶的细胞所竞争尚且未知。

研究方法

细菌菌株和培养基

Bacterial strains and media

在本研究中使用的细菌类型有：Bo ATCC 8483, B. thetaiotaomicron VPI 5482 Bv ATCC 8482, 以及 B. fragilis NCTC 9343. 如前面所述，细菌是在培养基中培养的。

细菌培养

Bacterial culture

为了在固定培养基中生长，将含有血红素和维生素K(BHIS)的脑心输注盘(inoculated from brain heart infusion)中的细菌接种到基础培养基(BS)中，隔夜培养至固定相，然后在新鲜BS中稀释1：10，生长至对数生长中期(mid log)。在对数生长中期，用离心法将细菌颗粒化，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，然后接种在规定的培养基中。用于补充已定义培养基的碳水化合物包括果糖(F 2543，Sigma)，果糖寡糖(FOS；OraftiP 95，Beneo-Orafti group)，Levan(L 8647，Sigma)，支链淀粉(10120，Sigma)和菊粉(OraftiHP，Beneo-Orafti group)。左旋维甲酸和支链淀粉在H中以1%w/v进行蒸压。水透析使用3.5kD MW膜(滑动-A-裂解透析磁带，ThermoScientific)。从Sigma购买短链脂肪酸乙酸、丙酸和琥珀酸。用10N NaOH中和2mm的原液，使原液的pH值达到7.2-7.3。所有培养物均在37°C厌氧条件下培养。用分光光密度(OD 600)定量细菌生长。用功率波分光度计(Biotek)在96孔平底微滴度板上进行200μ的细菌培养。将盲肠制剂中的小鼠肠道细菌培养在BHIS板上进行定植实验。所产生的菌落在条件培养基中的菊粉最小培养基或菊粉分解产物中进行生长试验。Bo在菊粉中生长，含有如前所述的菊粉分解产物。

类杆菌突变体的建立

Creation of Bacteroides mutants

创建了缺失突变体，编码BT 3698或BT 1760的基因在拟杆菌(Bacteroides The Taiotaomicron)VPI 5482，BACOVA_04502 Bo ATCC 8483 BACOVA_04503、BACOVA_04502/3、BACOVA_04504或BACOVA_04505 Bo ATCC 8483被移除。
将被删除区域的上游和下游的DNA片段使用附件中列出的引物进行PCR扩增。PCR产物经BamHI、EcoRI和/或MluI基因工程酶切入引物(补充资料表1)，并通过三种途径连接到pNJR 6的合适位点。所产生的质粒被共轭地转移到类杆菌用辅助质粒R 751标记的菌株经红霉素抗性筛选。通过PCR筛选突变基因型。

PUL基因在缺失突变体中表达的克隆

Cloning of PUL genes for expression in deletion mutants

利用扩展数据表1中列出的引物对BACOVA_04502、BACOVA_04503、BACOVA_04502/3、BACOVA_04504、BACOVA_04505或BACOVA_04504/5基因进行PCR扩增。PCR产物经酶切后连接到小鼠的BamHI或KpnI位点。类杆菌（Bacteroides）表达载体pFD 340。在突变体中引入了含有正确的插入方向与载体启动子相关的质粒。类杆菌菌株大肠杆菌用辅助质粒RK 231。

单一、两种、三种共培养实验

Mono-, co- and tri- culture experiments

在规定的液体培养基中进行细菌单细胞培养和共培养实验，在规定培养基加入之前，按规定的单一培养方式培养细菌。将无菌磁搅拌棒加入到培养管中，置于厌氧室内的摇动机架内的培养管中。对于条件培养基实验，Bo WT，Bo Δ04502，Bo Δ04502/3，Bv，或Bf在菊粉培养基或0.125%果糖培养基中生长。收集条件培养基，过滤灭菌，37℃孵育72小时。条件培养基用无额外碳水化合物的特定培养基补充，并用于培养Bv。 Bo Δ04502/3条件培养基在无碳水化合物的条件培养基中，使用2 kD MW膜(滑动-A-裂解透析盒)进行透析。单独培养的Bo在固体琼脂糖上，将指示浓度的4μL菌点在最小的菊粉琼脂糖平板上。在一定时间后，从琼脂糖板上切下斑点状斑块，再悬浮在PBS中，稀释后用BHIS进行计数。用琼脂糖平板上的混合液培养或切片对WT和等基因糖苷水解酶或多糖裂解酶突变体进行定量和鉴别，然后选择大约100个菌落，用文件1中列出的引物进行PCR检测WT或突变基因型。进行基因型筛选BtWT和BtΔ3698采用文件1中两组引物。下图为Bo/Bv, Bo Δ03533(WT)和Bo Δ03533Δ04502(Δ04502)精氨酸生长素突变体共培养。Bv在添加50μg/ml精氨酸的微量菊粉琼脂糖平板上，与WT相比，精氨酸不影响或限制生长。在BHIS板上的菌落被复制到固定的葡萄糖板上，这支持了Bv的生长而不支持Bo Δ03533或Bo Δ03533Δ04502的生长。

薄层色谱

Thin-layer chromatography

为了评估单个特征的重要性，我们采用了重排特征重要性(Permutation feature importance， PFI)技术。PFI通过对单个特征向量的排列来测量预测质量的变化(R2评分降低)。质量信号下降越多，该特征越重要。这些被认为是最重要的特征进一步采用累积局部效应(ALE)的方法评估，以确定微生物物种丰度发生微小变化时年龄预测的变化。ALE方法采用如下算法实现：对所选的95个物种，每一个物种组成一个分位数值表(5%步展)。每个分位数的局部效应(LE)是通过测量预测的平均变化来计算，这些预测方面的变化是通过左右边界值代替观测特征的丰度实现的。每个分位数的ALEs是通过将前面所有的LEs相加并以结果为中心使每个分类单元的平均效应为零来计算的。

培养基的气相色谱分析

Gas Chromatographic Analysis of Culture Media

色谱分析采用Shimadzu GC14-A 系统火焰离子化检测器(FID)(岛津公司，日本京都)。采用含有10 mm乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、异己酸、己酸和庚酸的挥发性酸混合物(Matreya，Pleasant Gap PA）。这是一种含有10毫米丙酮酸和乳酸和5毫米草酸、甲基丙二酸、富马酸和琥珀酸的非挥发性酸混合物(Matreya，Pleasant Gap PA)。

BACOVA_04502-3的克隆、纯化及酶学分析

Cloning, purification, and enzymatic analysis of BACOVA_04502-3

为了获得纯化的BACOVA_04502和BACOVA_04503蛋白，将这些基因分别克隆到pET16b的Bam HI位点
。些结构的设计使得pET16b编码的His标记取代了这些蛋白质的SpII信号序列，从而允许它们的溶解性。重组质粒转化为大肠杆菌BL 21(DE3)，生长为OD600在0.6-0.7的范围内，加入0.4mM的IPTG诱导重组基因的表达，再加4 h后，基本分离出了His标记的蛋白。使用 Dynabeads TALON paramagnetic beads用于酶促分析，使蛋白以磁性珠结合的形式添加到菊粉培养基中，这样可以方便地去除消化后的酶。作为对照，产生于同一过程的珠子大肠杆菌BL 21(DE3)只含有载体pET16b。为Bo生长分析(在菊粉培养基中加入50μ1的珠子(25μl含His-04502，25μl含His-04503)或等体积的Dynabead缓冲液(未消化菊粉)。在37℃下培养24h后，用磁铁去除含有该酶的微球，用培养基(消化或未消化的菊粉)进行培养。Bo WT和Bo Δ04502。

无菌小鼠实验

Gnotobiotic mouse experiments

在适当情况下，用无菌动物进行纵向分析，而不是随机。实验用动物的数量是由生物研究的优先顺序决定的。实验中的纵向分析野生型与突变型的比率，Bo在不断变化的环境条件下，允许内部对照、个体内部的比较。将小鼠置于不含多糖的特殊饲料中(65%w/v葡萄糖，无蛋白质，添加除精氨酸外的所有必需氨基酸)。所有饮用水中添加精氨酸50μg/ml。小鼠在无菌饮水中给予1%菊粉(w/v)。给小鼠接种指示菌约10⁸活菌（生长到对数生长期）在小鼠皮毛上。接种后不同时间点的粪便稀释液被接种到BHIS板上，并按上述方式进行基因分型。益生菌实验污染的预先排除标准，由厌氧板上的菌落（比Bo或Bv具有明显形态）或菌落（在有氧条件下的检出限大于10² CFU/mL）确定。在无菌条件下处死2~8周龄雄性瑞士韦氏小鼠。切除肠，注意保持盲肠完整。切除后2分钟内，将盲肠转移到厌氧室，将盲肠内容物混合，用10 mL预还原磷酸盐缓冲液加0.1%半胱氨酸稀释。
将200μL灌胃给每只被安置在无菌最佳笼中的小鼠。将盲肠内容物涂在LKV(REMEL)板上，富集菌体。不同的菌落组成用16S PCR进行检验。每组小鼠每笼2只，每笼3只。收集盲肠内容物并将其涂在确定的菊粉板上。Bo根据菊粉琼脂糖平板上不同的菌落形态，列举了在传统饲养的盲肠种群中不存在的细菌形态。

主要结果

在补充数据中显示了实验重复，所有p值均来自学生t检验。图中每项实验所报告的方差的统计显着性，图中所有中心值均为均值。误差条是平均值的标准误差。

图2. 菊粉表面消化介导的种间合作是通过互惠稳定的

a, 无菌小鼠用Bo WT或Δ04502/3进行单色处理，并在添加了菊粉的无多糖饮食中保存2周。然后用常规饲养小鼠的盲肠内容物给小鼠灌胃。灌胃后第5天，盲肠内容物被镀以计数Bo（每组5只生物复制小鼠）

b, 用Bo WT或Δ04502在规定的菊粉培养板上进行单培养或共培养时的bv计数。Bv/Bo WT共培养中bv的数量α，p=0.001。单独Bv；ψ，p=0.001 vs.Bv/Bo WT共培养中bv的数量vs.bv/Δ04502共培养中Bv的数量α，p=0.003 vs。单独Bv（n=2，细胞培养生物学重复）。7和99用于其他独立实验。

c, （左）围绕Bo WT或BoΔ04502/3或单独在菊粉琼脂糖板上以不同距离电镀的Bv贴片的照片。（右）与Bo wt或boΔ04502/3相同距离或单独在菊粉板上培养5天后Bv的计数。

d, 单培养或与Bv共培养时BoWT或Δ04502的计数。p值与用于统计分析的线/基 因型的颜色相关度。p值表示在指定的时间点对给定条件下的单培养和共培养进行比较。Bo从Bv那里得到的好处是，当以更少的Bo开始时，它是最强大的。描述的是开始约10⁶ Bo的CFU。（n=3，第1、2天细胞培养生物复制；n=2，第4天生物复制）。

e, WT和Δ04502/3比值菊粉平板上共平板培养或无Bv平板独立培养，在开始和第2天（n=3，细胞培养生物复制）。

f,接种（第0天）和不同时间点（第4、7、11、14、18天）的粪便中wt和Δ04502/3与bo wt和Δ04502/3的比例。第7天，无多糖饮食中添加了菊粉。Bv是在第14天引入的。费舍精确检验比较Bo WT和Δ0450 2/3（第14天前）和（第18天后）的比值。每只小鼠的p值为0.0001，具有显著性。切换到菊粉饮食后，粪便中Bo CFU最大，添加BV后，Bo WT的丰度较Δ04502/3有所改变，但不影响Bo的总 CFU。

图3 通过04502/3在体内交叉喂养和种间合作实现Bo和Bv之间互利共生的空间。

a, 独立实验，n=4生物复制。

b, 独立实验，n=3细胞培养生物复制。

c, 实验散点图，n=3细胞培养生物复制。

d, 三只无菌小鼠（n=3 小鼠生物学重复数量）共定植后21天粪便中|WT和Δ04502/3的比值，以菊粉作为唯一的膳食多糖（前Bv），然后在引入Bv（后Bv）后4天。每个面板显示单个鼠标的前后Bv比率。p值为费希尔精确检验，比较每只小鼠的Bo WT和Δ04502/3定殖前后和Bv的频率。在第21天，所有小鼠都以更高比例的突变体（在最低面板中描绘的小鼠中范围为86%）定植，每只小鼠在引入Bv后的WT比例有统计学意义的增加。

e, 在0.5%菊粉（上）或果糖（下）中，以1:1的比例添加0.125%果糖最低培养基或新鲜0.125%果糖最低培养基对照的0.5%菊粉（上）或果糖（下）在过滤早期原木无菌条件培养基的最小培养基中的生长，OD 600与Bv或Bo在0.125%果糖最低培养基或新鲜0.125%果糖最低培养基中的生长相匹配。在（e）中，数字是指在所示时间点通过未配对的双尾学生t检验比，较绿色（g）、红色（r）或黑色（b）值的p值（<0.05，<0.01， *<0.001），n=2个细胞培养生物学重复数量。对于所有面板，误差条代表标准误差，（d）为双尾学生t检验中得出的p值。

总结

本研究证明采用编码BT 3698或BT 1760基因的拟杆菌(Bacteroides The Taiotaomicron)进行实验，利用单一、两种、三种共培养实验进行培养，并对实验结果利用薄层色谱、培养基的气相色谱分析、BACOVA_04502-3的克隆、纯化及酶学分析这三种方法进行分析，使用无菌小鼠进行动物实验，最后对数据进行方差分析确定其可靠性。

本文所确定的两个基因位点及其改造的分析方法将为我们进一步理解微生物的相互作用关系提供帮助。

Reference

1. Rakoff-Nahoum, Seth, Kevin R. Foster, and Laurie E. Comstock. “The evolution of cooperation within the gut microbiota.” Nature 533.7602 (2016): 255. https://www.nature.com/articles/nature17626
2. Nature：肠道菌群是如何进行内部合作的？https://www.mr-gut.cn/papers/read/1091873576

译者简介

冯雨彤，浙江中医药大学，本科在读。

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