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读书笔记002---瞬时表达的T-DNA是否插入了基因组

已有 1244 次阅读 2020-4-24 23:19 |系统分类:科研笔记

       最近在和人讨论植物病毒载体的优劣,理所当然的拿农杆菌介导的T-DAN插入法做比较。没错,我就是那个有事没事经常跟人掐架的人,正式点称为"Argue"。当然知己知彼方能百战不殆,今天晚上就看了些农杆菌介导瞬时表达(transient expression)的文章。


         之前一直很疑惑瞬时表达的T-DNA究竟有没有进入细胞核,有没有整合到基因组上。正好看到了介绍这个方法的原始文献。发于1989年“Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium”。其实实验思路现在看起来很简单,瞬时表达,对应的是稳定整合表达(stable integration),差别在于时间,瞬时的表达时间短,稳定的可长时间表达。他们实验也是一个做了time course的表达观察。


         材料是Petunia Mitchell,应该是一种矮牵牛。感觉那时候矮牵牛特别popular,比如说植物中发现RNAi, 也是用的矮牵牛,那个迷人的花色,,咳咳,跑题了哈,,回到矮牵牛,他们把叶子取下来可以进行体外培养甚至再生。具体方法原理可以去植生所徐麟实验室网页了解,虽然徐老师做的是拟南芥,但是原理应该还是一致的。

        标记基因是GUS,具体见Fig.1.携带这个质粒的有两种农杆菌,其中一种用于T-DNA 转移的virB基因被突变掉了,丧失的转移T-DNA的能力,用来检测是否是T-DNA转移介导的表达(尤其是瞬转)。 然后将叶片与农杆菌一起孵育,然后观察标记基因GUS的表达。丧失T-DNA 转移能力的农杆菌没法在叶片中实现GUS的表达。完整的农杆菌转染的结果见Fig.2,AB为共培养两天后的结果,CD 为四天后的结果,E为三天后的结果。F为九天后的结果。所以一开始表达是逐渐的增强,三四天达到最强,随后逐渐减弱,但是在叶脉附近还可以看到表达(Fig.2 F),其实也容易理解,稳定插入基因组的较少, 稀拉拉的几个细胞染色是不容易见到的,但是维管束的形成层有分裂能力啊,可以将携带T-DNA的细胞增殖成簇,就能看到染色了。

        正好转染了stem cell 也是一件概率事件。怎么才能把稳定转染的信号放大呢?他们很聪明的进行了卡那筛选, 这样没有转入带标记基因的cassette或者后期丢失的细胞就会筛死, 剩下的带T-DNA的细胞就可以增殖,形成愈伤组织(Fig. 2G)甚至芽(Fig. 2H),将信号放大,而且还证明了这些表达是通过遗传传下来的,是稳定插在染色体上的。

      总结下来,瞬转大致是农杆菌介导的T-DNA complex 是转入细胞核进行转录翻译的,但是这样高效的转入是短时的,未实现插入基因组上,稳定遗传。 

      好,故事结束,方法简单,实验材料也选的好。经典的实验。也看到后面有人再跟进,也不过是讨论改进些细节(Kapila et al.,1997).




            Fig.2.    Histochemical GUS staining of leaf discs.




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