更快看清世界—并行焦斑荧光辐射差分超分辨显微成像

封面 | 张智敏, 黄宇然, 刘少聪, 匡翠方, 曹良才, 刘勇, 韩于冰, 郝翔, 刘旭. 共路并行荧光辐射差分超分辨显微成像[J]. 中国激光, 2021, 48(16): 1607002

【封面解读】 本封面体现了荧光辐射差分超分辨荧光显微并行焦斑扫描的实现过程。荧光辐射差分超分辨显微方法是一种利用正负共聚焦显微图像的后期差分处理来提升成像分辨率以及降低背景噪声的方法。利用偏振相关空间光调制器（SLM）分别对激发光的垂直偏振光和水平偏振光进行相位调制，可以在样品面上形成距离可控的双焦斑（黄色的实心焦斑和空心焦斑），以此实现两幅图像的同时采样，进而可提升成像速度。

背景介绍

共聚焦显微镜是生物学、生命科学等领域中观察细胞尺度的结构的重要仪器。通过与样品面共轭的针孔对离焦杂散光的限制，共聚焦显微镜可以实现接近由衍射成像系统孔径导致的阿贝衍射极限分辨率的成像。

共聚焦显微成像是一般生物细胞学研究的常用工具，一般共聚焦成像系统的分辨率在半波长左右。然而目前的共聚焦显微镜在分辨率上仍不足以支持对细胞器、蛋白质等更小尺度的样品的观察。因此，研究人员在共聚焦显微系统的分辨率提升问题上投入了大量的研究，基于共聚焦显微系统的超分辨显微方法也应运而生。

荧光辐射差分超分辨显微方法（FED）是一种利用正负共聚焦显微图像的差分后期处理来提升成像分辨率以及降低背景噪声的方法，由浙江大学刘旭教授、匡翠方教授团队于2013年提出。其本质是可以在相同波长的激发光下利用空心焦斑的暗斑区域来提取实心焦斑里的高频信息，在不需要特殊荧光标记的样品上也可以实现超分辨显微成像，具有普适性好、背景噪声低等特点。但是该方法需要获取两幅共聚焦图像来得到一张超分辨显微图像，这大大降低成像速度，不利于在快速运动的活细胞中进行成像研究。

创新研究

为了能够更进一步提升FED的成像速度，浙江大学刘旭教授、匡翠方教授团队进一步提出了一种共路相位调制的并行焦斑扫描方法，将FED的成像速度提升为原来的两倍，更加适合活细胞显微成像。

共路调制并行扫描方法利用偏振相关空间光调制器（SLM）分别对激发光中的S偏振光和P偏振光分别进行相位调制，其中涡旋相位调制负责形成空心暗斑，而闪耀光栅调制负责把激发光中实心亮斑和空心暗斑错开一定距离，以此实现样品面上双焦斑聚焦结果，进一步实现双焦斑并行扫描以提升FED的成像速度（图1）。

图1 共路并行荧光辐射差分超分辨显微系统

由于该方法是在样品表面将实心焦斑和空心焦斑错开一定距离而实现并行扫描并行采集，因此采集的图像会有一定的错位，需要对该错位距离进行标定，然后通过平移与裁切实现图像对齐，再通过FED方法实现分辨率的提升，如图2所示。

图2 共路并行FED处理过程

为了进一步验证该系统的分辨率，团队利用100 nm荧光颗粒进行分辨率标定测试。如图3所示，实验结果表明，该系统的分辨率能够达到133 nm，并且图像的背景噪声得到了进一步的降低。

图3 100 nm荧光颗粒分辨率测试

同时，为了检验该系统在生物细胞中的应用效果，团队采集了细胞波形蛋白的成像结果（图4）。通过对比a1与b1、a2与b2，可以看出在较为复杂的生物细胞中，共路并行FED方法能够在实现背景噪声降低的同时提升信噪比与分辨率，具有较为优秀的显微成像性能。

图4 细胞波形蛋白成像结果

总结与展望

通过SLM来实现共路并行焦斑扫描的方式既可以优化光斑质量保证成像效果，也可以进一步提升FED的成像速度，是一种较为实用的成像方法。

接下来，团队将进一步利用全息相位调制的方法实现四焦斑或者六焦斑扫描以实现更高的成像速度提升。

课题组介绍

浙江大学刘旭教授、匡翠方教授领衔的超分辨显微课题组对当下多种热门的超分辨显微方法皆有深入研究，例如受激辐射损耗超分辨显微方法、单分子定位超分辨显微方法、结构光超分辨显微方法等。除此之外，团队也发展了多种新型的超分辨显微方法，例如荧光辐射差分超分辨显微方法、非线性焦斑调制超分辨显微方法、饱和竞争超分辨显微方法等。团队已在Nature Communications、Physical Review Letters、Optica、ACS Photonics等期刊发表多篇高水平论文。