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什么样的lncRNA研究能登顶Science

已有 16634 次阅读 2016-11-15 10:38 |个人分类:生信分析|系统分类:科研笔记

长链非编码RNA(Longnon-coding RNA,LncRNA)是长度大于 200个核苷酸的非编码 RNA。LncRNA一直是研究的热点,其作用机制多元,并不像miRNA那样具有固定的模式,这也是研究的难点之一。


那如何去开展LncRNA研究呢?


在转录组研究中,研究思路不外乎高通量测序,差异表达分析,选择感兴趣的基因进行功能研究。在上篇推文中,作者生理实验加生信分析,做到功能预测这一步,就发了4.5分SCI,那如何发高一点,再高一点的SCI呢?


今天就一起来看看Science上的lncRNA研究是如何做的。


文章案例

The STAT3-binding long noncoding RNAlnc-DC controls human dendritic cell differentiation

研究领域:免疫         相关基因: lnc-DCSTAT3            PMID: 24744378  

杂志:Science          IF: 34.661              样本:GSE54143 GSE54401


这篇文章主要探究lncRNA在树突细胞(dendritic cell,DC)分化及功能中的作用。作者发现了一个关键的lncRNA(lnc-DC),并用实验验证了其功能和作用机制,思路图如下:




             图1 文章思路图(mono指单核细胞monocytes,DC指树突细胞Dendritic cells;DC由mono分化而来的)


那为啥就能发Science呢?


发science首先立意要新,作者研究的是lncRNA在DC细胞分化和功能中的作用,在当时14年很少有lncRNA在免疫方面的研究。且2011诺贝尔生理学/医学奖授予的就是树突细胞研究者。树突细胞能递呈抗原,激发T细胞应答,可通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的树突细胞回输给病人,诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应,所以DC在肿瘤的免疫治疗中具有巨大的应用前景。


其次要有新的重大的发现。作者发现了lncRNA在细胞质中一种新的作用机制,其直接结合信号分子来调节翻译后修饰,在当时拓宽了对lncRNA作用机制的认识。


最后还需要系统严谨的实验作为支撑。作者从最初lncRNA的筛选,验证,到目标lncRNA自身特性,表达和功能机制的研究,可以说在lncRNA的研究上已经很深入,也很系统。实验一环扣一环,正反证,反正证,真正是用实验结果堆出来的文章。


下面具体看下作者是如何一步步做lncRNA的研究的。


1、筛选lncRNA

作者首先用芯片HTA 2.0 transcriptome microarray assay检测了mono分化至DC过程中(7天)lncRNA的表达变化,在124个显著变化的lncRNA中(foldchange>16,p<0.05),有24个被诱导。

                                                              图2  DC分化过程中lncRNA热图


为确保结果的准确性和可靠性,作者又用二代测序IlluminaHiSeq 2000 检测了0点和第7天的lncRNA表达情况,99个lncRNA差异显著(fold>4,FDR<0.05)

                                      图3 二代测序lncRNA表达情况(红色为显著差异,fold>4,FDR<0.05


对两个结果取交集,筛选了表达倍数高的lnc-DC作为下一步的研究对象。


2、验证lnc-DC

为确保结果的准确性,进一步用Northern blot对lncDC的表达进行了验证,确证lnc-DC在DC分化过程中的高表达。在验证这一步,还可以选择qPCR,两者各有优缺点,可以自行选择合适的方法。


图4 lnc-DC的Northernblot验证结果


3、Lnc-DC自身特性研究

可对目标lncRNA进行基因组定位,序列保守性,全长及结构等方面进行研究。


基因组定位

可用Genomebrowser对lnc-DC进行基因组定位,并查看其临近基因。调控邻近基因表达是lncRNA的一种作用机制。

Genomebrowser http://genome.ucsc.edu/


序列保守性估计

可用PhastCons进行序列保守性估计。

PhastConshttp://genome.ucsc.edu/

                                图5 lnc-DC和邻近基因HEATR6序列的保守性估计


转录起始位点、结束位点及全长验证

可用RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证


                                                 图6 RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证结果


结构解析

可用RT-PCR进行5‘端和3’端结构探究,发现lnc-DC有poly A尾和5‘端帽子。


                                                                  图7 RT-PCR验证lncDC结果


编码能力验证

将lnc-DC转入HEK293T细胞进行表达验证,其无编码能力,同时用生信方法对其序列进行编码能力预测,与实验结果一致。

Coding potential calculator http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp


                                        图8 lnc-DC编码能力验证结果(左,片段构建;右,免疫印迹结果)


4、表达研究

表达特异性

作者选取其他免疫细胞进行比对,分别通过实验及数据库中的数据分析,发现lnc-DC只在cDC(conventional DC)中特异性表达。


图9 lnc-DC在不同细胞中表达结果


表达机制研究

组蛋白修饰可调控基因表达,作者采用CHIP-seq和CHIP-qPCR进行组蛋白修饰研究,并通过DNAase I 的敏感性来衡量染色质的疏松状态。在lnc-DC位点组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰,染色质较为疏松的状态及转录因子PU.1促进了lnc-DC在cDC中的特殊表达。


图10 lnc-DC表达机制研究结果


5、Lnc-DC功能研究

功能探索

作者用RNAi敲除及过表达来研究lnc-DC的功能,敲除和过表达结果相反。敲除lnc-DC后,作者分别从基因、蛋白的表达及功能的影响来考察lnc-DC的功能。最后表明lnc-DC促进了DC的分化,对DC抗原的递呈及增加T细胞增殖上具有重要作用,同时小鼠体内外实验也有相同结论。


                                                                     图11 lnc-DC RNAi基因表达结果



图12 lnc-DC RNAi蛋白表达结果



图13 lnc-DC RNAi后DC抗原递呈能力(左)及激活T细胞增殖情况(右)


机理研究

在机理研究中,可用排除法,先考察是否和目前报道的作用机制一致。


LncRNA的作用机制中,其中有cis顺式调控和trans反式调控。Cis顺式调控影响邻近基因的表达,在之前的实验环节,发现lnc-DC敲除对邻近基因表达没有影响,可排除lnc-DC cis顺式调控作用。


接下来作者用FISH对lnc-DC进行细胞定位,显示lnc-DC处于细胞质中。LncRNA在细胞质中有两种作用方式,可作为ceRNA与miRNA结合恢复mRNA的翻译,或与ALU元件作用促进STAU1介导的mRNA衰退。RNA免疫沉淀 (RIP)表明lnc-DC不与AGO2作用,排除了lnc-DC和miRNA的作用机制。用生信分析表明lnc-DC没有与ALU的作用序列,所以lnc-DC有新的作用机制。


作者用pull-down(蛋白质体外结合实验)联合MS发现lnc-DC与STAT3(转录因子)相互作用,并用系列实验找出了lnc-DC和STAT3的作用位点及调节方式,详细过程请参见文献。下图是作者推测的lnc-DC的作用机制模拟图。



图14 DC分化过程中lnc-DC的作用机制模型


在mono分化至DC的过程中,组蛋白H3K4me3和H3K27ac的增加伴随着染色质的疏松,促进转录因子PU.1的结合,增强了lnc-DC的表达。lnc-DC转录后即转运至细胞质,与STAT3结合,阻止了SHP1对STAT3的去磷酸化,增强了STAT3的信号通路,最终促进了DC细胞的分化。

在这简单梳理了作者的研究思路,从lncRNA的筛选,验证到功能机理研究,详细可参见文献。

这篇文章对我们有什么启发呢?


首先立意一定要新,想想有什么热点是可以与自己的研究方向结合的。其次是严谨的思路和系统的实验,这些是完全可以参照和套用的。14年lncRNA研究的science的标准在这,请大家用心体会……

LncRNA方法总结

LncRNA筛选

芯片

Human transcriptome microarray assay 2.0

Mouse transcriptome microarray assay 1.0


测序


LncRNA验证

Northern blot/qPCR

目标lncRNA研究

基因组定位 genome browser http://genome.ucsc.edu/

序列保守性估计 PhastCons http://genome.ucsc.edu/

转录起始位点,终止位点验证及全长克隆 RACE

结构解析 PT-pcr

编码能力预测 转基因-免疫印迹

LncRNA表达

表达特性

Northern blot/qPCR

数据库数据


表达机理

组蛋白修饰——CHIP-seq/CHIP-qPCR

染色质状态——DNAase I

序列分析

LncRNA功能

敲除/过表达

RNA免疫印迹(RIP)

Pulldown实验

拓展知识:

如何分分钟get权威文献

三点搞定GEO数据上传

差异基因结果解读

GO和pathway结果解读及分析  视频教程

如何用path-net挑选核心pathway

共表达网络分析

趋势分析

芯片meta分析

如何轻松发4.5分SCI




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3 孟佳 强涛 wqhwqh333

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