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皮肤干细胞治疗的发展历程 精选

已有 4443 次阅读 2020-4-18 16:48 |个人分类:科普集锦|系统分类:科普集锦| 干细胞, 再生医学, 干细胞治疗, 基因治疗

本综述已经被中国《自然》杂志收录:http://www.nature.shu.edu.cn/CN/10.3969/j.issn.0253-9608.2020.02.003,转载请注明出处。


摘要:大疱性表皮松解症病人通过全身换皮已经实现了根治。从不治之症到可以治疗,皮肤干细胞疗法走过了漫长的发展历程。从不经意间发明皮肤干细胞体外培养的技术,到利用皮肤干细胞再生皮肤组织,到治疗深度烧伤病人和角膜灼伤,最后到治疗遗传性皮肤病。这个临床医学上的突破是干细胞治疗和基因治疗结合的典范。本文将回顾这一发展历程,展示科学发展的规律,为基因治疗和干细胞治疗在其它领域的发展提供思路。

 

关键词 基因治疗、干细胞治疗、皮肤干细胞、大疱性表皮松解症

 

2017年,世界各大科技新闻网站都在关注和报道一则医学新进展:叙利亚7岁的“蝴蝶”男孩哈桑(Hassan)用自己的皮肤细胞更换了几乎全身的皮肤,因而获得了新生,再也不用承受皮肤溃烂、感染的痛苦[1]。这次“换皮”成功标志着曾经无法根治的绝症变为可以治疗,它是干细胞治疗发展的里程碑。科学能走到这一步,是科学家们前赴后继不断探索积累而成的。

 

哈桑得的是什么病?

哈桑的皮肤就像蝴蝶的翅膀一样脆弱,他的皮肤常年起水疱、破损和感染,整个人都是血红色的;站着疼、坐着疼、躺着也疼,他常年在痛苦地生活着,挣扎在死亡的边缘。他得的是一种罕见的皮肤遗传病,临床上叫做大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa ,EB)。

皮肤是覆盖在我们人体最外层的器官,它似乎没有大脑、心脏等器官那么之光重要,但是它有两个和人生死攸关的功能:一个是作为人体与外界环境的屏障,保护人体免受外界病原体如细菌、病毒等的侵袭;另一个是皮肤还能保持体内的水分,防止人们脱水而死。此外,它还有物理防护、感觉、排汗、排油脂、调节体温等功能。

皮肤由上皮和真皮构成,上皮和真皮的交互界面是基底膜,基底膜的黏连蛋白将二者锚定在一起。细胞和细胞之间由细胞外基质构成,细胞外基质中的黏连蛋白将细胞组合在一起形成组织。如果细胞间的黏连蛋白出现功能异常,细胞间或者上皮和真皮之间出现间隙,组织间液以及免疫细胞等会充斥其间形成水疱,使皮肤受损甚至糜烂。而哈桑正是层黏连蛋白-332(laminin-332)的其中一个编码基因出现了突变。

无独有偶,新闻中也曾用“保鲜膜男孩”报道过类似的中国病人,由于皮肤常年受损,身体持续大面积处于腐烂状态并散发恶臭,父母每天在他上学前都用保鲜膜把他的身体严严实实地裹起来,以减少皮肤摩擦受伤以及掩盖恶臭。遗传性大疱性表皮松解症属于罕见性遗传病,在美国据统计大约5万个新生儿中会有一例[2]。迄今为止,人们发现至少有20种编码角质纤维蛋白、细胞黏连蛋白等负责细胞间锚定的基因突变导致这种疾病[3,4]。不同的基因突变决定了病人症状轻重不同,严重者皮肤或者粘膜上皮轻微摩擦、挤压都会导致水疱。除了上皮脆弱、起疱、破损和容易感染外,病人通常还伴随着其它上皮异常,如指甲和牙齿异常、严重结疤、粟立肿、角化病和色素沉着异常等[5]。重症患者护理不足的话通常会在婴幼儿期间死亡,而后期也容易得皮肤鳞状细胞癌而死亡。

遗传大疱性表皮松解症又可以细分为四种类型[4,5]:1、单纯性大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa simplex,EBS),这类疾病的特征是上皮内起水疱,发生变异的蛋白有角质蛋白KRT5KRT14、负责细胞骨架连接的PLEC基因等,显性遗传居多;2、交界性大疱性表皮松解症(junctional epidermolysis bullosa,JEB),这类疾病是源于层黏连蛋白或者胶原蛋白有缺陷,导致上皮和真皮间的基底膜起水疱,通常是隐性遗传的,哈桑的laminin-332编码基因突变正是属于这一类;3、营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa ,DEB),这是另一个编码胶原蛋白 COL7A1突变导致的,患者的水疱也是在基底膜中产生,可以是显性或者隐性遗传;4、Kindler综合征 (Kindler syndrome),它是因为负责微丝蛋白和细胞外基质相互作用的粘着斑(focal adhesion plaques)的基因 KIND1发生了突变,属于隐性遗传。还有一类类似的皮肤病叫做表皮松解性鱼鳞病(epidermolytic ichthyosis,EI),它早期症状与和单纯性大疱性表皮松解症类似,但是随后会产生鱼鳞藓和角化过度,这类疾病通常是因为角质蛋白KRT1或者KRT10突变引起的。

对于皮肤松解症的病人,预防措施主要是加强护理,防止皮肤受伤起疱和感染;临床干预措施主要是处理伤口、缓解疼痛、控制感染、治疗并发症等,护理成本高昂,没有根治的办法。

 

开端:皮肤干细胞的体外扩增

要解释哈桑的全身换皮治疗,首先要先说明皮肤干细胞在体外是如何扩增的。皮肤干细胞位于上皮的基底层,它每天复制更新替换死去和脱落的皮肤细胞。意外发明皮肤干细胞体外扩增这项技术的是来自先后在麻省理工学院和美国哈佛医学院的Howard Green教授。他最初感兴趣的是怎么从培养的小鼠畸胎瘤细胞中获取到更多的有关胚胎发育的信息,因为畸胎瘤源于生殖细胞,瘤体中会含有类似于胚胎发育形成的皮肤、毛发、牙齿、骨骼、油脂、神经组织等,所以他把畸胎瘤组织解离成单细胞后放在含有培养液中培养[6]。培养多天后,他实验室的研究人员生发现在成纤维细胞的背景中形成了看起来像是上皮细胞的克隆。他们实验室试图获取这种上皮细胞,但是因为分离的细胞生长很差并未成功。在体内组织中,上皮细胞和真皮细胞是紧紧地附着在一起的,他们交互的界面是基底膜;基底膜像海绵一样,吸收上皮和真皮细胞释放的因子从而相互影响和支持。因而,模拟体内的情况将上皮细胞和真皮细胞共培养有可能让上皮细胞生长得更好,畸胎瘤类似上皮的细胞也是在成纤维细胞的背景下生长形成克隆的。于是他们在培养皿中先是添加了致死剂量辐射过的3T3成纤维细胞,然后在3T3滋养细胞上再放入畸胎瘤衍生的上皮细胞,结果这些上皮细胞生长得非常好[7]。紧接着,他们测试人的上皮细胞,将一小片人的皮肤解离出上皮细胞,并将它们在3T3细胞支持下进行培养,也获得了成功[8]

后来他们发现,上皮细胞在成纤维滋养细胞上生长,可以形成大小不等的克隆。最大的全克隆(Holoclone)具有最好的干性和最大的增殖能力,最小的小克隆(Paraclone)的干性最差且增殖能力最小,处于中间的半克隆(Meroclone)具有相当强的增殖潜能和干性,但小于全克隆[9]。这些不同干性的克隆和后面要说的组织再生和维持的能力直接相关。

 

皮肤干细胞再生皮肤

紧接着Howard Green教授问的问题是培养皿培养的上皮细胞是否能够再生出皮肤。他们用分散酶(dispase)将长满的人的上皮细胞整片地从培养皿上消化下来,然后将剥离下来的细胞片移植到免疫缺陷小鼠皮肤伤口上,结果这样的细胞片在小鼠上生成了人的皮肤。由于人的皮肤形态结构与小鼠本身的皮肤不同,并且人的皮肤会特异表达一些蛋白,切片染色的结果确证在小鼠的表面长出的是人的皮肤而而非小鼠自身修复产生的皮肤[10]。这一结果证明,体外培养扩增的上皮细胞,具有再生皮肤的能力。这个动物实验为这一技术的临床应用奠定了坚实的基础。

 

皮肤干细胞治疗烧伤病人

因为体外培养的皮肤干细胞能够大量扩增,且扩增的细胞能再生皮肤,Howard Green就大胆提出假设,能否将一个已经被大面积烧伤的人的残留皮肤进行细胞培养和扩增,并将之用于大面积皮肤的再生[6]?Howard Green与 Nicholas O’Connor医生合作,在皮肤烧伤的成年人进行小规模试验。他们用患者的小片皮肤培养的细胞片覆盖胳膊烧伤处,结果如预期一样,患者在烧伤处再生出了皮肤补丁[11]。这个结果证明了这一假设的可行性。

1983年的一天,波士顿的烧伤研究所所长John Remensnyders医生打电话给Howard Green,说有一对5岁和7岁的兄弟,火焰烧伤了他们身体表面超过90%的皮肤,根本无法用常规治疗方法进行自体皮肤的移植,问他是否想要尝试他们实验室的技术,用体外大规模培养的皮肤细胞来进行移植治疗。Howard Green尽管觉得实验室从未培养过如此大量的皮肤细胞,但是鉴于两兄弟如果用常规治疗根本没有生存的机会,答应合作。他分别从两兄弟未烧伤的皮肤中取一小片皮肤,解离并培养皮肤细胞,制作成细胞片分次敷在清创后的伤口处。结果是实验成功,细胞片再生处皮肤并连接起来覆盖在表面。尽管没有再生出汗腺和毛囊,覆盖的皮肤也干燥脆弱,但是它使机体具备了防护和保水最重要的功能,两兄弟都幸存下来,并且生活了20多年[12]

需要特别指出的是,因为移植的是自体的细胞,所以人体很好地接纳了新的皮肤,不会产生免疫排斥反应。这是自体干细胞移植非常重要的优势。在此之前人们也怀疑单纯上皮细胞覆盖根本解决不了烧伤的问题,因为真皮无法再生的话,皮肤缺乏韧性。但是后面的实验结果证明,在上皮细胞覆盖伤口后,真皮也在它下面再生出来了[13]

 

角膜干细胞治疗

由于角膜上皮细胞与皮肤上皮细胞都来自于胚胎期人体最外层的一层细胞,所以角膜上皮细胞与皮肤上皮细胞有很多相似的性质。角膜干细胞位于角膜缘[14],有人尝试用Howard Green开发的办法,用3T3成纤维滋养细胞培养角膜缘细胞,取得了成功[15]。有一类病人,因为一只眼睛被化学灼伤破坏了角膜缘干细胞而失明。意大利M.Deluca和G.Pellrini实验室采集正常眼睛的角膜缘干细胞(健康眼睛被采集角膜缘干细胞后,余下的干细胞会再生补充而不受什么影响),并用滋养细胞对角膜缘干细胞进行培养后,之后更是采用最新改进的方法,将角膜缘细胞放在纤维蛋白基质中来培养,这样细胞很容易成片剥离。剥离的细胞片敷在去除不透明组织的失明的眼睛上,结果再生出了完整的角膜[16-18]。值得一提的是,干细胞移植修复是永久性的修复,因为干细胞在组织中定植后可以源源不断地供给以维持细胞的代谢更新。在超过100例的病人中有80%的症状得到了缓解,有的病人在移植后超过10年,一直拥有完好的角膜上皮,眼睛也永久复明[18]

 

干细胞与基因改造结合治疗遗传性皮肤病

M.Deluca和G.Pellrini实验室还尝试将表皮细胞导入基因来治疗遗传性皮肤病。他们研究的交界型大疱性表皮松懈症患者,在等位基因Laminin 5-ß3中的一个发生缺失,另一个等位基因包含了一个移码突变。他们用逆转病毒载体将Lam5-ß3的全长cDNA导入到病人体外培养的皮肤细胞,然后移除胳膊部分破损的皮肤并用体外培养的且经过基因改造的细胞片取代,结果在治疗部位的皮肤获得了很好的修复[19]。虽然他们仅是取代了一小部分皮肤, 但是这个试验成功后,全身换皮治疗大疱性松解症在理论上已经完全可行了。

几年之后就发生了开头的一幕,同样是M.Deluca实验室取一小片哈桑的皮肤,将它解离出来的皮肤细胞进行体外培养,并用逆转录病毒导入缺失的基因;皮肤细胞大量扩增源源不断获得细胞片,用细胞片分次移植和取代病变的皮肤。几个月后,哈桑80%的皮肤获得了更换,他再也不用忍受皮肤损伤带来的痛苦,从此他也可以像其他孩子一样在阳光下跑跳玩耍了[1]

 

展望

哈桑的例子是医学发展的典型的例子,从不治之症到最后可以治疗,一切都源于基础研究的进展。Howard Green在他回忆的文章里面也不无感慨地说:“在1974年,我还没打算要研究体外细胞疗法或者治疗人类烧伤。在那时,当时的想法是:可以从培养的小鼠畸胎瘤中获取到更多的有关胚胎发育的信息。”正是对于科学问题的追问,才诞生了皮肤干细胞体外培养的方法,也才在后面一步步地演进,发展出可以治疗大面积烧伤、眼睛灼伤以及遗传性皮肤病的新疗法。

当然,这种方法治疗大面积皮肤烧伤以及大疱性表皮松解症目前并没有完全推广开来,其中最主要的障碍就是高昂的治疗成本。细胞在体外大量培养扩增、分多次反复手术替换皮肤、病人在此过程中的防护都需要大量的人力物力。

人们已经发现,培养的上皮细胞的干性维持对于上皮再生至关重要。角膜上皮移植中失败的例子,多数是因为在角膜缘干细胞的分离和体外培养扩增的过程中出现了分化,因而再生角膜难以为继。而在哈桑的例子中,人们发现再生皮肤中少量的皮肤干细胞渐渐地取代了其它移植的干性不强的细胞[1]。如何调试培养条件,在体外培养中最大限度地模拟体内的环境,保持细胞的干性是未来最重要的课题。

此外,逆转录病毒随机插入的办法可能会导致某些细胞发生癌变,大的基因片段在逆转率病毒中进行高效的克隆和包装都有一定难度,而且一些显性遗传的突变无法用导入基因的方式修复。人们现在正在尝试用基因编辑新技术,比如TALENs 和 CRISPR/Cas9的办法在体外对体外培养的细胞进行基因修复,在实验室中取得了很好的效果[20-22]

[1]           Hirsch T, Rothoeft T, Teig N, Bauer JW, Pellegrini G, De Rosa L et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature 2017; 551: 327-332.

[2]           Fine JD. Epidemiology of Inherited Epidermolysis Bullosa Based on Incidence and Prevalence Estimates From the National Epidermolysis Bullosa Registry. JAMA dermatology 2016; 152: 1231-1238.

[3]           Prodinger C, Reichelt J, Bauer JW, Laimer M. Epidermolysis bullosa: Advances in research and treatment. Experimental dermatology 2019; 28: 1176-1189.

[4]           Has C, Fischer J. Inherited epidermolysis bullosa: New diagnostics and new clinical phenotypes. Experimental dermatology 2019; 28: 1146-1152.

[5]           Carulli S, Contin R, De Rosa L, Pellegrini G, De Luca M. The long and winding road that leads to a cure for epidermolysis bullosa. Regenerative medicine 2013; 8: 467-481.

[6]           Green H. The birth of therapy with cultured cells. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology 2008; 30: 897-903.

[7]           Rheinwald JG, Green H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell 1975; 6: 317-330.

[8]           Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975; 6: 331-343.

[9]           Barrandon Y, Green H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1987; 84: 2302-2306.

[10]         Green H, Kehinde O, Thomas J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1979; 76: 5665-5668.

[11]         Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells. Lancet 1981; 1: 75-78.

[12]         Gallico GG, 3rd, O'Connor NE, Compton CC, Kehinde O, Green H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. The New England journal of medicine 1984; 311: 448-451.

[13]         Compton CC, Gill JM, Bradford DA, Regauer S, Gallico GG, O'Connor NE. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 1989; 60: 600-612.

[14]         Schermer A, Galvin S, Sun TT. Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells. The Journal of cell biology 1986; 103: 49-62.

[15]         Lindberg K, Brown ME, Chaves HV, Kenyon KR, Rheinwald JG. In vitro propagation of human ocular surface epithelial cells for transplantation. Investigative ophthalmology & visual science 1993; 34: 2672-2679.

[16]         Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, Zingirian M, Cancedda R, De Luca M. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet 1997; 349: 990-993.

[17]         Rama P, Bonini S, Lambiase A, Golisano O, Paterna P, De Luca M et al. Autologous fibrin-cultured limbal stem cells permanently restore the corneal surface of patients with total limbal stem cell deficiency. Transplantation 2001; 72: 1478-1485.

[18]         Rama P, Matuska S, Paganoni G, Spinelli A, De Luca M, Pellegrini G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England journal of medicine 2010; 363: 147-155.

[19]         Mavilio F, Pellegrini G, Ferrari S, Di Nunzio F, Di Iorio E, Recchia A et al. Correction of junctional epidermolysis bullosa by transplantation of genetically modified epidermal stem cells. Nature medicine 2006; 12: 1397-1402.

[20]         March OP, Lettner T, Klausegger A, Ablinger M, Kocher T, Hainzl S et al. Gene Editing-Mediated Disruption of Epidermolytic Ichthyosis-Associated KRT10 Alleles Restores Filament Stability in Keratinocytes. The Journal of investigative dermatology 2019; 139: 1699-1710 e1696.

[21]         Jackow J, Guo Z, Hansen C, Abaci HE, Doucet YS, Shin JU et al. CRISPR/Cas9-based targeted genome editing for correction of recessive dystrophic epidermolysis bullosa using iPS cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2019.

[22]         Takashima S, Shinkuma S, Fujita Y, Nomura T, Ujiie H, Natsuga K et al. Efficient Gene Reframing Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa with CRISPR/Cas9. The Journal of investigative dermatology 2019; 139: 1711-1721 e1714.




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