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流式细胞术研究细胞学机制:"cell-cell contact"

已有 3461 次阅读 2016-9-8 20:50 |个人分类:研究方法|系统分类:科研笔记| style, display, 细胞学, contact

                                                                               

巧用流式细胞术研究细胞学机制:

简介

细胞间的相互作用方式大体上可以分为两种,一种是通过分泌细胞因子,趋化因子等可溶性的蛋白质相互作用,这个过程不依赖于细胞间接触;另一种是依赖于细胞间接触,通过细胞表面的配体与受体结合,传导信号最终起作用。

细胞间接触机制的研究方法也比较固定:首先,体外可用Transwell实验培养两种细胞,阻止细胞-细胞接触,进而观察细胞-细胞接触对于该生物学现象的作用;其次,体内观察到这种细胞-细胞接触的现象;最后,干扰某个/些分子,破坏细胞-细胞接触,进而改变该生物学现象。

实验小白今天就为大家介绍一下如何巧用流式细胞术研究细胞-细胞接触机制。

例1:Nat Immunol 2009“B cell–T cell conjugates”

大量的研究表明B细胞诱导Tfh细胞产生的过程是依赖于细胞-细胞接触机制的。2009年Nature杂志上发表的文章[1]就用流式细胞术证明了这一机制。

[1] Reinhardt RL, Liang HE, Locksley RM. 2009. Cytokine-secreting follicular T cells shape the antibody repertoire. Nat Immunol 10(4):385-393.

第一步:体内发现CD19+CD4+ cells

众所周知,CD19阳性的细胞是B细胞,而B细胞表面是不表达CD4或者CD3分子的。我们现在观察到CD4+CD19+的细胞,初看好像很不合理。仔细分析这篇文章的材料方法,小鼠脾脏和淋巴结取出后,机械性研磨、裂解红细胞、流式染色过程中都未加入EDTA,而且圈门过程也未去除双联体细胞。因此,这群CD4+CD9+cells有可能就是B cell-T cell conjugates。

第二步:分析CD19+CD4+细胞大小(也就是FSC的值)

如果CD4+CD19+细胞真的是T cell-B cell conjugates,那么这群细胞的大小应该是CD4+T细胞大小和CD19+B细胞大小之和。如上图所示,原始文献中是这样描述的:Further confirming their identification as B cell–T cell conjugates, cells that expressed both T cell and B cell markers were twice the size of single cells。

第三步:分选CD19+CD4+ cells,加入EDTA打破细胞间连接,然后流式验证是CD19+B细胞和CD4+T细胞。

文献中是这样描述的:The resulting single cells segregated into approximately equal numbers of CD4+ and B220+ single-positive populations, consistent with their original purification as B cell-T cell conjugates.

PS: Dual-reporter 4get-KN2 mice (IL-4 reporter).

例2:PLoS Pathog 2014“Macrophage-T cell contact”

看完上面的例子实验小白被吓到了,流式还真的能这么用啊?我们也尝试一下,照葫芦画瓢[1]。

[1] Chen X, Yang X, Li Y, Zhu J, Zhou S, Xu Z, He L, Xue X, Zhang W, Dong X, Wu H, Li CJ, Hsu HT, Kong W, Liu F, Tripathi PB, Yu MS, Chang J, Zhou L, Su C. 2014. Follicular helper T cells promote liver pathology in mice during Schistosoma japonicum infection. PLoS Pathog 10(5):e1004097.

1. 体内存在F4/80+CD4+ cells

和例1类似,我们发现小鼠脾脏中也有F4/80+CD4+ cells,而且这群细胞绝大多数都表达CD3分子,初步提示这群细胞是巨噬细胞-T细胞的结合体。

2. 流式检测F4/80+CD4+细胞大小(FSC)

如上图所示,我们发现F4/80阳性的巨噬细胞大小为300,CD4+T细胞的大小为200,而F4/80+CD4+细胞的大小为500。进一步提示F4/80+CD4+ cells 很有可能是巨噬细胞与CD4+T细胞的结合体。

3. 分选F4/80+CD4+cells,用EDTA破坏细胞间粘连后,流式确证改双阳性细胞是巨噬细胞与CD4+T细胞的结合体。

流式分选出F4/80+CD4+ cells,用EDTA处理后,流式检测的结果显示基本上是等比例的F4/80+CD4-CD3-macrophage和F4/80-CD3+CD4+T cells。




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1 秦逸人

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