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活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性成分筛选研究

已有 3467 次阅读 2014-7-9 15:18 |个人分类:科研论文|系统分类:论文交流| 中药活性成分筛选, 权重分析, 谱效学

活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性成分筛选研究

杨乾栩1,程孟春1,王莉1,阚晓溪2,朱晓新2F,肖红斌1, 2

1中国科学院大连化学物理研究所,中科院分离分析化学重点实验室,辽宁 大连 116023

2中国中医科学院中药研究所,北京100700

摘要:活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性部位和成分的筛选、提取、验证研究。分别采用HPD大孔树脂柱和聚酰胺柱获得具有成分差异的瑞香狼毒部位,并用MTT法考察不同部位对人肺癌细胞A549的抑制活性。结果显示不同部位的A549抑制活性呈现离散分布。权重分析表明,色谱图上的33.97 min成分及30-39 min部位对A549抑制作用较大。活性实验表明,30-39 min部位要优于瑞香狼毒醇提物,33.97 min成分在100 μg/mL水平内,与阳性药顺铂作用相当,但作用方式完全不同。在离散活性条件下,权重分析方法对中药活性成分或部位,具有较好的筛选效果。

关键词:瑞香狼毒;离散活性数据;权重分析;活性成分;抗肿瘤

Antitumor components screening in Stellera chamaejasme L. under the case of discrete distribution of active data

YANG Qian-xu1, CHENG Meng-chun1, WANG Li1, KAN Xiao-xi2, XIAO Hong-bin1*ZHU Xiao-xin2F

1CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical Physics, Dalian 116023, China

2Institute of Chinese Materia Medica Academy, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

Abstract: Screening, extracting and validating antitumor components and compounds in Stellera chamaejasme L. under the case of discrete distribution of active data. In this work, different components in Stellera chamaejasme L. were collected by HPD macroporous resin and polyamide resin column, and their antitumor activity to A549 were tested by MTT assay. Activity results indicate that activity of components in 30-39 min are prior to Stellera chamaejasme L. extract, and activity of components in 33.97 min are equivalent to positive drug, cis-platinum at 100 μg/mL, but with totally different mode of action. Under the case of discrete activity, the weight analysis is capable of screening active components and compounds of natural product.

Key words: Stellera chamaejasme L.; Discrete-active data; Weight analysis; Bioactive components; Antitumor

 

癌症是人类最主要的“杀手”之一,抗癌药物的发现,一直是药物研究工作者的不朽使命。

瑞香狼毒,瑞香科狼毒属植物狼毒(Stellera chamaejasme L.)的干燥根,俗名又叫断肠草,其味苦辛,性平,具有逐水祛痰,破积杀虫之效,在我国具有悠久的用药历史[1]。现代药理表明,瑞香狼毒提取物具有较强的抗肿瘤,抗病毒,抗真菌,酶抑制等活性[2]。然而瑞香狼毒成分复杂,已报道的主要包括香豆素类、生物碱类、二萜类和黄酮类[3, 4]。而相关的活性报道,大部分集中在狼毒提取物的活性研究[5, 6],单体活性研究相对偏少,其药效物质基础研究薄弱,尚需要进一步挖掘。

谱效学研究是建立指纹谱与相应活性之间的关系,进而用于发掘中药有效成分或成分群 [7, 8],或基于此的质量控制研究[9]。目前已有的谱效学相关研究,大部分集中在采用回归建模为基础的方法[10, 11],在模型的基础上,通过不同的策略实现活性成分的挖掘。对于采用模型回归分析结合变量筛选的谱效学分析方法,其风险性在于对数据要求较为严格,包括1)离散点对结果影响较大。离域值较大的实验数据,会使回归曲线向离散点偏移,从而造成预测结果的不准确;2)活性数据要具有较好的连续性。连续性较差的活性数据,其构造的回归模型可信度较低。而目前的中药分离手段相对较为粗犷,分离能力有限,导致成分差异较为严重,从而造成不同部位的活性差异较大。另外由于生物活性的药效曲线特点,尤其是当药物作用为S型药效曲线,此时随机获取组分的活性往往呈现高低活性较多,适中活性较少的分布特点,因而造成了活性数据分布相对离散的特点。

在本文,我们针对中药部位活性差异较大的特点,提出了针对离散活性数据的活性成分筛选方法。将化学计量学中的权重模型[12],引入并应用在瑞香狼毒的抗肿瘤活性成分分析,筛选出一个活性较高的部位和一个化合物,并对结果进行了验证,取得了有意义的结果。

 

材料与方法

药品与试剂  瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)药材,由中国中医科学院中药研究所朱晓新研究员提供,并由何希荣副研究员鉴定为瑞香狼毒正品。HPD100大孔树脂和聚酰胺树脂购于沧州宝恩化工有限公司。DMSOMTT购于Amresco公司。阳性药注射用顺铂,山东罗欣药业股份有限公司。DMEM培养基购于GIBCO公司。胎牛血清购于杭州四季青公司。胰蛋白酶购于Solarbio公司。乙腈和甲醇为色谱纯试剂,购于Sigma试剂公司。

实验仪器  Waters2690液相系统,配有PDA检测器,柱温箱,自动进样器(Waters,美国)。Waters DP400制备系统(Waters,美国),配有DAD检测器和手动进样器。实验用水由Milli-Q制备(Millipore,美国)。酶标仪(TECAN,瑞士)。CO2饱和湿度培养箱(HEAL FORCE,澳大利亚)。

细胞株  A549细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,置于37 5% CO2饱和湿度培养箱孵育以供试验。

瑞香狼毒提取  称取1000 g瑞香狼毒药材,用7 L 80%乙醇浸泡(以浸没药材为准)1小时后,回流提取三次,每次2小时,合并并浓缩提取液至浸膏状即获得瑞香狼毒提取物。

瑞香狼毒分段分离 HPD大孔树脂分段分离部位:称取69.5 g HPD100大孔树脂填料装入内径1.3 cm的玻璃柱,活化及水平衡后,上样瑞香狼毒提取物2.9 g。分别用三倍柱体积的水、10%乙醇、20%乙醇,依次10%递增至80%乙醇,再用100%乙醇洗脱。收集不同浓度乙醇洗脱部位后,浓缩冻干获得瑞香狼毒大孔树脂洗脱部位;聚酰胺树脂分段分离部位:称取37.76 g 聚酰胺树脂填料装入内径1.3 cm的玻璃柱,活化及水平衡后,上样瑞香狼毒提取物3.36 g。其它分离条件与HPD大孔树脂操作相同。

分析色谱条件  采用CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6*250 mm, 5 μm, SHISEIDO)。流动相含乙腈(A相)水(B相),梯度洗脱,洗脱条件:A相起始为25%25 min升至50%40 min升至80%,并维持至55分钟。流速1 mL/min,选择检测波长290 nm,进样20 μL

制备色谱条件  采用Chromatorex C1810*250 mm, 10 μm, Fuji),60%甲醇等度洗脱,流速18 mL/min,选择检测波长290 nm

A549抑制实验 取对数生长期A549细胞,常规消化,计数并调整细胞浓度为5×104/mL,取96孔细胞培养板,每孔加入100 μL细胞悬液,于37,5%CO2,饱和湿度的培养箱中培养过夜后,每孔分别加入100 μL不同浓度的瑞香狼毒实验样品,每个浓度平行3个复孔。并设立阴性对照(每孔加入100 μL培养基)和阳性对照组(每孔加入100 μL不同浓度的顺铂溶液)。在37 , 5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养48小时后,每孔加入15 μL 5 mg/mLMTT,四小时后小心甩去孔内培养液并加入150 μL DMSO,充分震荡溶解后于570 nm下酶标仪检测吸光度。分段组分样品活性实验中,各组分样品终浓度为100 最/mL,验证实验的阳性对照药顺铂及验证样品,终浓度分别为1.563.126.2512.52550100 μg/mL。计算细胞抑制率公式:抑制率=A阴性对照组-A实验组)/A阴性对照组-A空白对照组)×100%

色谱数据预处理 将所有组分数据,以txt文本形式导出后,采用自编软件包ChromP进行色谱峰对齐[13],及基线校正[14],并输出峰表。

活性数据预处理  瑞香狼毒组分,根据对A549抑制活性,按照如下方法分类:活性小于0.15的组分定义分类为-1(低活性组),活性大于0.6的组分定义分类为1(高活性组),其余组分定义分类为0(中等活性组)。

权重分析 采用文献[11]中的权重分析公式:

其中,CT分别代表所研究的两组,nCnT分别表示两组的样本数,要满足nC + nT = nj代表的是某一具体变量,因此xcj, xcj, xtjxtj分别代表j变量中,每组中具体的样本值。在本文,分组分别是-101,变量是每一个具体的色谱时间点,样本值则是具体的色谱强度值。

变量权重公式从组间方差和组内方差两方面,定义了一个变量对于两组分类的贡献大小。变量j权重值越大,则说明变量j对活性分组的分类作用比较大,则可能是潜在的活性化合物。

权重分析采用自编软件MultiDA[15]WeightAnalysis模块进行分析。

结果

1瑞香狼毒提取物及部位

HPD大孔树脂和聚酰胺树脂分离,共获得20个瑞香狼毒组分,由于聚酰胺10%20%乙醇洗脱部位含量太少,因此参与后续活性实验的实际只有18个组分。图1是以瑞香狼毒提取物为代表的色谱图。

 

Figure 1 HPLC chromatogram of Stellera chamaejasme L. extract. The main components were marked. Peaks 1: Isomohsenone; Peaks 2: Isomer of mohsenone; Peaks 3: Isoneochamaejasmine A; Peaks 4: Unknow; Peaks 5: Sikokianin A; Peaks 6: Sikokianin B; Peaks 7: Isomer of sikokianin; Peaks 8: Unknow; Peaks 9: Chamaejasmenin B.

2 A549细胞活性考察

不同瑞香狼毒组分对A549抑制活性效果见图2。从图2来看,不同瑞香狼毒组分具有差异较大的活性分部。对于HPD组分,活性较高部分位于70%100%乙醇洗脱部位;对于聚酰胺组分,活性较高部分分布在40%60%乙醇洗脱部位。图3是组分活性数据的频率分布图,明显可见,活性较高和活性较低的组分数量较多,而活性适中的组分数量较少,活性数据分布连续性较差。呈现明显的两端样本多,中间样本少的分布趋势,对于活性在15-50%之间,仅有四个组分。

 

Figure 2 A549 inhibitory activity of Stellera chamaejasme L. components. From left to right in figure, HH to H10 represent H2O, 10% ethanol to 100% ethanol components by HPD macroporous resin, and JH to J10 represent H2O, 10% ethanol to 100% ethanol components by polyamide resin, respectively.

 

Figure 3 Frequency distribution of A549 inhibitory activity. The x axis is activity of all components, and the y axis is the frequency that an activity occurs.

3 色谱数据处理

通过ChromP软件处理后,结果输出为一18*3294矩阵,即18个瑞香狼毒组分样本,3294个色谱时间扫描点,每一数据点为一峰强度。

4 变量权重分析

由于我们主要目的是挖掘对高活性和低活性影响较大的部位或化合物,即对高活性和低活性分组具有较大区分能力的化合物或部位,因此以-1组和1组之间的权重分析结果为主,以0组和1组之间的权重分析结果为辅助参考。

 

Figure 4 Weight analysis of different group. A) Weight analysis of group -1 and 1; B) weight analysis of group 0 and 1. The bigger the weight value it is, the more important the corresponding components.

4反映了权重分析的结果。从-1组和1组(图4A),即高活性组和低活性组比较来看,33.97分钟所对应的成分对高活性组和低活性组的区分能力较大,表明它可能具有较高的A549抑制活性,而同时该成分对0组和1组也具有较高的区分能力(图4B)。从图4A结合图4B来看,30-39分钟所对应的部位的权重值,整体上优于其它部位,表明该部位可能也具有较好的抑制A549活性。

另外,从权重值来看,33.97分钟对区分-11组的权重值达5.8,远高于包括30-39分钟的其他部位,也从一定程度上提示33.97A549抑制活性要优于30-39分钟部位。

5 潜在活性部位及活性成分制备

针对HPD大孔树脂的组分分离结果,及30-39 min部位和33.97 min成分的保留时间,发展了它们的制备方法,制备流程如下描述:

1)将瑞香狼毒提取物过HPD大孔树脂分离柱,分别用60%乙醇和100%乙醇洗脱,收集100%乙醇洗脱部位,浓缩即获得30-39 min部位;

2)将100%乙醇洗脱部位过HPD大孔树脂分离柱,分别用80%90%100%乙醇洗脱,收集90%乙醇洗脱部位;

3)将90%乙醇洗脱部位适当浓缩后,用高效制备色谱纯化,即获得33.97 min成分。33.97 min成分经核磁鉴初步鉴定为狼毒宁BChamaejasmenin B)。

6 活性验证

5是瑞香狼毒提取物,30-39 min部位,33.97 min成分和阳性药顺铂的药效比较图。

 Figure 5 A549 inhibitory activity comparison of Stellera chamaejasme L. extract, 30to39 min component, 33.97 min compound and cis-platinum at different concentrations level.

从图5来看,筛选的30-39 min部位和33.97 min化合物的活性,整体呈现33.97 min化合物优于30-39 min部位,30-39 min部位优于狼毒提取物的特点。相对于狼毒提取物和30-39 min部位,33.97 min化合物具有更小的起效浓度和更大的活性值,从一定程度上说明33.97 min化合物可能是30-39 min部位的药效物质基础。通过比较33.97 min化合物和阳性药顺铂的药效来看,当作用浓度在50100 μg/mL时,二者具有基本相同的A549抑制率。而从药效曲线来看,33.97 min化合物与顺铂完全不同,33.97 min化合物呈现典型的S型浓度药效曲线,而顺铂则表现为双曲线型的浓度药效曲线,表示二者可能具有不同的药物作用方式[16]

如果33.97 min化合物是瑞香狼毒抗A549的主要药效物质基础,由于它呈现了S型药效曲线,这也从一定程度上解释了瑞香狼毒组分活性呈现高低活性较多,中等活性较少的离散分布特点。

 

讨论

基于变量筛选的中药活性成分筛选,可以采用回归或者判别的方法处理。对于回归的方法,往往要求数据分布均匀,且受离异值影响较大。然而在实际的生物活性实验中,由于实验成本的限制,数据点往往较少;且受药物本身作用方式的影响,使得很多活性数据分布较为离散。在这种条件下开展中药活性成分筛选,采用判别的方法,要比采用回归的方法,更加稳健和高效。

权重分析是一种通过比较组内离差和组间离差,从而确定变量对分组重要性程度的方法。离散活性数据,可以根据一定的原则转换为活性分组变量,因此对于离散活性情况下的中药活性成分筛选,可以通过权重分析的方法,确定中药活性部位或成分。本文采用权重分析的方法,对瑞香狼毒抗A549活性进行了活性成分筛选,筛选出了30-39 min部位和33.97 min化合物,并通过活性验证确定了所筛选部位和化合物活性的优越性,表面了我们方法的有效性。

除可采用权重分析的方法筛选离散活性情况下的中药活性成分外,也可采用线性判别分析结合变量筛选的其它模式识别方法,具体方法的应用应根据数据特点和需求进行选择。除此之外,连续活性数据的离散化后,也可以采用权重分析处理,但可能会丢失部分数据信息。总之,根据实验活性数据的特点,选择适合的筛选方法,不断完善谱效学的相关学科盲点,才能促进中药精简,加快中药现代化。

致谢

感谢“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09307-002-01)给予的经费支持。

Reference

[1] SUN X, SUN F, WU P. Shennong's Herbal (神农本草经) [M]. Beijing: Scientific and Technical Documentation Press 1996.

[2] LIU W, WANG C. Research on chemical constituents, bioactivity, and application of Stellera chamaejasme[J]. Drugs & Clinic (现代药物与临床), 2010, 25: 26-30.

[3] ZHAO L, LOU Z Y, ZHU Z Y, et al. Characterization of constituents in Stellera chamaejasme L. by rapidresolution liquid chromatographydiode array detection and electrospray ionization timeofflight mass spectrometry[J]. Biomedical Chromatography, 2008, 22: 64-72.

[4] SU X-L, LIN R-C, WONG S-K, et al. Identification and characterisation of the Chinese herb Langdu by LCMS/MS analysis[J]. Phytochem Anal, 2003, 14: 40-47.

[5] HUO Q, WANG Y, GAO R, et al. Study on atioxidation for extraction of total-flavonoid in stellera chamaejsme L. in vitro[J]. Animal Husbandry and Feed Science (畜牧与饲料科学), 2010, 31: 83-85.

[6] FAN J, JIA Z, XIE J, et al. Serum-pharmacological effects of Ruixiang Langdu (Stellera chamaejasme L.) abstract on proliferation of hepatoma cells[J]. Medical Journal of National Defending Forces in Northwest China (西北国防医学杂志), 2000, 21: 90-91.

[7] CHAU F T, CHAN H Y, CHEUNG C Y, et al. Recipe for uncovering the bioactive components in herbal medicine[J]. Anal Chem, 2009, 81: 7217-7225.

[8] YANG Q, LIU Y, WANG L, et al. Screening of bioactive components in epimedium for osteoporosis treatment by model population analysis[J]. Acta Pharmaceutica Sinica (药学学报), 2012, 47: 1205-1209.

[9] ZHANG Y, YAN D, ZHANG P, et al. Quality control of Shuanghuanglian freeze-dried powder for injection based on its HPLC-ELSD fingerprints and biological profiles[J]. Acta Pharmaceutica Sinica (药学学报), 2010, 45: 93-97.

[10] LU H, LIANG Y, QIAN P. Profile-effect on quality control of Houttuynia cordata injection[J]. Acta Pharmaceutica Sinica (药学学报), 2005, 40: 1147-1150.

[11] DUMAREY M, VAN NEDERKASSEL A, DECONINCK E, et al. Exploration of linear multivariate calibration techniques to predict the total antioxidant capacity of green tea from chromatographic fingerprints[J]. J Chromatogr A, 2008, 1192: 81-88.

[12] YI L Z, HE J, LIANG Y Z, et al. Plasma fatty acid metabolic profiling and biomarkers of type 2 diabetes mellitus based on GC/MS and PLS-LDA[J]. FEBS Letters, 2006, 580: 6837-6845.

[13] TOMASI G, VAN DEN BERG F, ANDERSSON C. Correlation optimized warping and dynamic time warping as preprocessing methods for chromatographic data[J]. J Chemom, 2004, 18: 231-241.

[14] EILERS P H C, BOELENS H F M. Baseline correction with asymmetric least squares smoothing[J]. Leiden University Medical Centre report, 2005.

[15] YANG Q X, ZHANG L, WANG L, et al. MultiDA: Chemometric software for multivariate data analysis based on Matlab[J]. Chemom Intell Lab Syst, 2012, 1161-8.

[16] CHOU T C. Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies[J]. Pharmacol Rev, 2006, 58: 621-681.

 




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