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基于模型群体分析的淫羊藿抗骨质疏松活性成分筛选研究

已有 5090 次阅读 2013-12-18 10:32 |个人分类:科研论文|系统分类:论文交流| 谱效淫羊藿变量筛选

基于模型群体分析的淫羊藿抗骨质疏松活性成分筛选研究

杨乾栩,刘艳秋,王莉,肖红斌[*]

中国科学院大连化学物理研究所,中科院分析分离重点实验室,辽宁大连 116023

摘要:筛选淫羊藿中对破骨细胞生长具有抑制作用的活性成分。搜集不同产地淫羊藿药材,MTT法考察不同产地淫羊藿抗前破骨细胞RAW264.7活性。结果显不同产地淫羊藿的抗RAW264.7活性显著具有差别。采用模型群体分析,一个具有潜在活性的化合物宝霍苷I被筛选出。通过破骨细胞活性验证,发现宝霍苷I活性优于淫羊藿苷。模型群体分析方法适用于指导中药活性成分预测及发现,为中药活性成分筛选提供了新方法。

关键词: 淫羊藿;淫羊藿苷;宝霍苷I;活性成分;模型群体分析

Bioactive components screeningin epimedium for osteoporosis treatment by model population analysis

YANGQian-xu, LIU Yan-qiu, Wang Li, XIAO Hong-bin*

Dalian Instituteof Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China

Abstract: Screen bioactivecomponents for inhibiting osteoclast in epimedium. Method: In this work, weobtained epimedium from different habitat, and screened their inhibitoryactivity to RAW264.7 by MTT assay. Results indicate that epimedium in differenthabitat displaying significant activity difference. By means of modelpopulation analysis (MPA), we got a latent bioactive component, i.e.,baohuoside-I. Activity of baohuoside-I was validated and prior to icariin. Result:MPA can be used for bioactive components screening.

Key words: Epimedium; Icariin;Baohuoside-I; Bioactive components; MPA

 

骨质疏松常见于老人及绝经后妇女,属于全身代谢紊乱症,已被认为是全球发病率最高及致死性最大的健康疾病[1-3]。目前,随着老龄化人口的不断增加,骨质疏松的潜在危险正在逐渐增加。

淫羊藿作为中国传统中药应用非常广泛。现代药理表明,淫羊藿具有潜在的促进成骨细胞增值和分化,调节免疫系统,增强骨发生和抑制破骨发生等作用[4-7]。尽管目前有很多关于淫羊藿在骨质疏松相关的研究报道及应用,但是确切的淫羊藿中用于治疗骨质疏松的物质基础仍不清楚,很多报道仍将淫羊藿中含量较高的淫羊藿苷,朝藿定ABC作为其药效物质基础[8]

谱效学研究是建立指纹谱与相应活性之间的关系,进而用于发掘中药有效成分或成分群的变量筛选方法。目前已有一些相关报道。Ning[9]采用回归分析的方法筛选与镇痛、止呕相关的成分。Lu[10]通过共有模式分析鱼腥草的抗炎有效成分群。Chau[11]发展了SR-Plot的方法筛选了葛根中抗氧化的成分群。Qiu等采用响应面设计法筛选双黄连注射液中的抗流感病毒神经氨酸酶活性的组分[12]。然而目前的谱效学研究都只有筛选过程,筛选方法过于简单,且少有活性验证过程,无法确定筛选结果的可靠性。

模型群体分析由Li[13]提出,它主要通过随机选取不同变量和样本构建成新的亚数据,进而通过对亚数据建模和统计学分析来考察变量重要性。模型群体分析是一种基于模型优劣的统计学方法,相比于常规的t检验,偏最小二乘权重等来判断变量重要性的方法,模型群体分析的结果更加文件,且可以从一定程度上揭示变量的相互作用。在本文,模型群体分析方法首次被用来筛选淫羊藿中与破骨细胞活性相关的化学成分,并筛选出3个潜在活性成分,取得了有意义的结果。

 

材料与方法

药品与试剂 宝霍苷标准品,购于上海融禾医药科技发展有限公司,HPLC纯度大于98%。淫羊藿苷,实验室自制,HPLC纯度大于98%14产地淫羊藿详细信息见表1,从上至下分别是陕西,辽宁,四川,甘肃,广西,贵州,湖南,安徽,河北,江西,内蒙,黄山和黄山北。HPD100大孔树脂购于沧州宝恩化工有限公司。DMSOMTT购于Amresco公司,DMEM培养基购于GIBCO公司。胎牛血清购于杭州四季青公司。

Table 1 Information of epimedium purchased in experiment

Habitat

Weight

Purchase from

Northeast

500 g

BoZhou, TaoBao Shop

ShanXi

500 g

BoZhou, TaoBao Shop

LiaoNing

250 g

DaLian(Processed by mutton fat)

SiChuan

250 g

BoZhou, TaoBao Shop

GanSu

250 g

BoZhou, TaoBao Shop

GuangXi

200 g

ChongQing TCMM Market

GuiZhou

200 g

ChongQing TCMM Market

HuNan

200g

ChongQing TCMM Market

AnHui

44 g

DaLian

HeBei

250 g

HaErBin Crude Drugs Market

JiangXi

250 g

HaErBin Crude Drugs Market

NeiMeng

250 g

HaErBin Crude Drugs Market

HuangShan

200 g

DaLian

North of HuangShan

200 g

DaLian

 

实验仪器  Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF UPLC/MS液质联用系统,DAD检测器,柱温箱,自动进样器(Agilent,美国)。乙腈和甲醇为色谱纯试剂,购于Sigma试剂公司。实验用水由Milli-Q制备(Millipore,美国)。单波长酶标仪(TECAN,瑞士)。CO2饱和湿度培养箱(HEAL FORCE,澳大利亚)

细胞株  RAW264.7购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,置于37 ℃5% CO2饱和湿度培养箱孵育以供试验。

淫羊藿总黄酮提取  淫羊藿药材碾碎后,称取2.05 g淫羊藿药材粉末,20.5 ml 70%乙醇超声提取20分钟,提取两次,合并并浓缩提取液。称取45.83 g HPD100大孔树脂填料装入内径1.3 cm的玻璃柱,活化及水平衡后,上样淫羊藿提取液。分别用三倍柱体积水和100%乙醇洗脱,浓缩100%乙醇部位后冻干获得淫羊藿总黄酮粉末。所有产地淫羊藿均上述方法进行处理。配制200 μg/ml的不同产地淫羊藿总黄酮溶液,准备液相分析。

色谱条件  采用Proshell 120 SB-C18色谱柱(3.0*150 mm2.7 μmAgilent),柱温45 ℃流动相含乙腈(A相)水(B相),梯度洗脱,洗脱条件:A相起始为25%7 min升至55%7.1 min升至100%,保持至10 min。流速0.5 ml/min,选择检测波长270 nm,进样2 ul

质谱条件  质谱正离子扫描模式,主要参数设置为毛细管温度320,干燥气8 L/min,雾化气45 psig,毛细管出口电压175 VSkimmer 65 VVCap 3500 V

RAW264.7抑制率实验 RAW264.7转移至96孔细胞板,每个孔内加入200 μg/ml终浓度的淫羊藿类黄酮(实际考察的淫羊藿类黄酮种类与表一稍有不同,详见结果讨论部分),每个组分平行5个试验孔。在37摄氏度下孵育24小时后,每孔加入20 μl 5 mg/mlMTT,四小时后吸出孔内培养液并加入200 ul DMSO,于490 nm下酶标仪检测吸光度。

质谱数据处理  淫羊藿原始数据首先用Trapper软件转化为mzXML格式,再通过XCMS[14]工具包进行不同产地淫羊藿数据的保留时间校正,峰滤噪,峰识别和峰对齐的处理。

模型群体分析 假设变量Xm*n矩阵,其中m表示样本数,n表示提取的成分数(在本文每个元素代表一个样本的提取成分的峰面积),Ym*1的向量(代表破骨细胞生长抑制率),则模型群体分析的方法可表述如下,简单来讲可以通过四个步骤完成:

1)每次从X的变量空间随机选择n*v个变量,从X的样本空间随机筛选出m*q个样本,将所选的样本和变量构成新的矩阵X0,同时从Y中选取相应的样本构成Y0。其中vq是小于1大于0的数。

2)建立X0Y0的偏最小二乘(Partial Least Squares, PLS)模型,评价每个模型的预测误差。

3)重复前两步骤N次,获得NPLS模型及相应的模型预测误差。

4)统计学分析每个变量的重要性。以变量I为例,在NPLS模型中获取含有变量IPLS模型集合Sk,并将相应PLS模型的模型误差集合计为NPEsNormal Prediction Errors)。同时将Sk中所有的变量I用随机数置换,再进行PLS建模,获得的PLS模型误差集合称之为PPEsPermuted Prediction Errors)。采用Mann-Whitney-Wilcoxon非参数检验计算变量INPEsPPEs的统计学差异,若p值越小且NPEs均值小于PPEs,则说明变量I对破骨细胞活性解释性较强,可能是是潜在的活性化合物。

通过上面的四步,即可判断每个变量是否为潜在活性化合物。由于p值与变量是否为活性化合物间呈反向关系,实际计算的是p值的负对数值(称之为COSS值)。COSS越大则说明变量IY的作用比较大,可能是潜在的活性化合物。

数据处理  数据预先做zscore标准化,所有处理过程均在Matlab 2011b上进行。

 

结果

1淫羊藿总黄酮基峰总离子流图

1是以内蒙产地为例淫羊藿总黄酮提取物的基峰离子流图,部分已知的成分及通过模型群体分析筛选的成分标记在上。

Figure1 Base peak of total flavonoid extract of Neimeng epimedium. The maincomponents and components screened by MPA were marked. Peaks: 1. Epimedin A, 2.Epimedin B, 3. Epimedin C, 4. Icariin, 5. Component 323/312, 6. Baohuoside I, 7.Component 67.

2破骨细胞活性考察

不同产地淫羊藿总黄酮对RAW264.7的作用效果见图2,其中标号YYH是由以岭药业提供的淫羊藿,标号HSDGHSXZ是黄山产地淫羊藿通过不同干燥方式获得的组分,标号LiaoNingShui是辽宁产地淫羊藿过柱后的水部位,其他标号均与之前介绍相同,这样实际有17个不同淫羊藿组分参与活性评价。从图上可见不同产地淫羊藿由于成分不同及成分含量不同造成不同的活性,其中辽宁,湖南,甘肃等产地的淫羊藿其活性较高,对RAW264.7的抑制活性达0.8以上,而江西,黄山北等部位的活性较差,甚至出现促RAW264.7增值的作用。正是由于不同产地淫羊藿具有不同的活性,为寻找决定不同活性的成分或成分群提供了数据支撑。

Figure2 Inhibitory activity of total flavonoid extract of epimedium in differenthabitat. Among them, YYH was kindly provided by YiLing pharmaceutical Co., LTD;LiaoNingShui is different extracted part of LiaoNing epimedium; HSDG and HSXZare obtained from HuangShan epimedium by different means of dryness; others areidentical to Table 1.

3质谱数据处理

通过XCMS17产地淫羊藿共检出474个分子量信息。这样构成了17*474的数据矩阵以供下一步建模。

4模型群体分析

参数设定为v等于0.2q等于0.7,偏最小二乘选择提取三个主成分来进行模型群体分析。图3反应了所有成分的COSS值,从中可见第21233231267号峰的COSS值最高,说明它们可能是潜在的决定淫羊藿活性的成分。

Figure3 COSS value of components extracted by XCMS. Component in x axis was sorted bytheir molecular weight in ascend order. Components with value more than 2 weremarked with RT and M+1 Peak.

4反映了212峰的质谱信息,根据其分子离子峰和碎片信息,以及文献参考[15],初步判断其为宝霍苷 I。最后通过宝霍苷标准品的出峰时间与212号峰比较,同时考察质谱信息,确定第212峰即为宝霍苷I

Figure4 MS profile of the 212 peak. The [M+1] is molecular ion peak (MIP) and [M-Rha+H2O+1]is fragment of [M+1].

对于332312号峰,通过其分子离子峰信息,猜测332可能是312的加钠峰,通过保留时间,确定二者实际是一个组分。然而通过比较文献,其可能结果比较多,由于缺少标准品,并不能确定其为哪种物质。另外,67号峰处在色谱峰的末尾处,这部分的分子量信息杂乱无章,而且含有溶剂带来的很大干扰,也不太容易判别其成分。从结果来看,模型群体分析筛选的三个成分都处在保留时间靠后的位置,因此提示我们对淫羊藿的质量控制也应该侧重非极性较强的成分。

5 活性验证

5列出了宝霍苷I和淫羊藿苷对前破骨细胞RAW264.7的抑制率曲线,从图中可以看出宝霍苷I的药效曲线呈S型,其抑制率最高可达91%,而淫羊藿苷的药效曲线呈双曲线型,其抑制率最高只有60%,在浓度大于250 μg/ml以后,曲线基本进入平台期。另外通过中效法[16]估计宝霍苷IIC50大概是77 μg/ml,而淫羊藿苷的IC50大概为190 μg/ml。这些都说明了宝霍苷I具有明显优于淫羊藿苷的效果,证实了通过模型群体分析的方法筛选得到的活性化合物是可靠的。同时相关文献也从其它机理方面证实了宝霍苷I的抗骨质疏松活性[17]

Figure5 Concentration Response curve of Baohuoside-I and Icariin. Solid circle andsquare represent icariin and baohuoside-I, respectively.

 

讨论

谱效学的概念提出已久,涉及到数学、分析化学、生物学等多学科。其中,难以建立合适的数学筛选模型为最大瓶颈。谱效学的数学建模类似于化学计量学中的变量筛选,即从成百上千的变量中寻找对所考察指标最有影响的变量或变量群。

模型群体分析是建立群体亚模型,统计分析变量重要性的变量筛选方法[13]。本文以中药淫羊藿为研究对象,以治疗骨质疏松活性—破骨细胞生长抑制活性为考察指标,建立二者之间的关联,发掘了对破骨细胞抑制活性最为相关的3个成分,其中之一鉴定为宝霍苷I。通过后续的实验验证,支持了我们所筛选的成分的优于淫羊藿的主要成分淫羊藿苷。以上结果表明,通过模型群体分析的数据挖掘手段有可能预测、筛选出中药的活性成分或成分群,具有潜在的应用价值。如果将谱效学的数据挖掘方法结合在线活性检测和制备色谱等手段,或可有效指导并快速、高效地进行中药活性成分筛选、制备及验证,从而加快中药现代化进程。

 

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基金项目:国家自然科学基金项目(81102739, 81001629

[*]通讯作者:Tel: 86-411-84379756,13500701169, Fax: 86-411-84379756

                Email: hbxiao@dicp.ac.cn

    第一作者:Email: yangqianxu@dicp.ac.cn

 



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