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适配体筛选的那些事~罗昭锋老师与群友的第一次交流记录.pdf

交流地点：QQ群

群名称：适配体aptamer/selex交流

群号：134854978

交流时间：2012年9月23日晚8点

下次在线交流时间：2012年10月21日晚8点

2012年9月23日晚8点，罗昭锋老师在适配体群中与大家进行交流，解答了大家在适配体筛选中遇到的许多问题，现将问题简单整理，可能整理的会有些错误请大家多多指教~~~~

问1：在做适体的PCR时候，循环数怎么确定呢？15个循环的量会不会不够呢？

罗老师答:关于PCR循环数的问题，有多篇文献讨论过。2006年加拿大的，2010年中国的一篇文献。文献如下，但这两篇文章的结果都是基于非变性CE电泳得出的结论，我本人认为并不可靠。建议利用Q-PCR来摸索扩增循环数，到达平台期再扩4-5个循环。但是这个问题还没有人能说清楚究竟多少循环合适。

罗老师给出上面提到的两篇文献相关信息，同时提出自己对文章结论的一些怀疑。

文章指出以不能出现非特异条带为准。文中所说的非特异条带，罗老师花了很长时间研究，其实就是不完全退火造成的，也就是说，如果用变性胶跑电泳的话，这些都是特异的产物。

1 Musheev, M. U. & Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Analytica Chimica Acta 564, (2006) 91-96.

2 Ji, Y., Wang, Q. Q., Fu, J., Gao, X. & Song, H. F. Optimization of Polymerase Chains Reaction Amplification for ssDeoxyribonucleic Acid Library Using Capillary Electrophoresis with Laser-induced Fluorescence Detection. Chinese Journal of Analytical Chemistry 38, (2010) 622-626.

问2：前几轮荧光定量PCR扩增后看扩增曲线到达平台后容易下探头，这是为什么呢？

罗老师答：往下走是正常的。我们用Q-PCR的曲线来检测筛选进程。筛选到后来，当你发现Q-PCR的曲线不再往下探头的时候，说明库容已经减小了。（在2011年11月中科大举办的核酸适配体筛选技术培训班上做过专门介绍）。

问3：做到后来克隆时候，做菌落PCR出来的是一条目的条带吗?变性胶是否为银染？

罗老师答：不是，我用gelred(2011年6月1日,买过2支gel red ,41003 Gel Red TM Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X in water 0.5 mL ¥679 Biotium)染色。效果很好的。上海开放生物有卖。我现在都是用高通量测序，不过比较贵。克隆的方法有些慢。

随后罗老师附上了他们8%变性胶的配方。

8%变性胶配方

并且指出，变性胶的上样buffer，也比较重要，生工的2xTBEbuffer没有biorad的效果好，但也可以使用。不过两者价格有差距，前者15ml，100块左右，后者450元。如果自己配，需要摸索一下，亦可以直接购买sigma的甲酰胺，加入一点染料，直接用作上样buffer，也是可以的。

网上查到生工的变性胶上样buffer，配方如下：

货号：SD6046 2x TBE-Urea Sample Buffer

(178mM tris-HCl pH 8.0, 178mM boric acid,4mM EDTA,7M Urea,24% ficoll,0.02% bromophenol blue,0.04% xylene cyanole FF)

问4：如果做克隆，您之前的结果好吗？

罗老师答：几年前曾经做过克隆的，不过效果不好，富集程度不够，而且合成后亲和力很弱。那是失败的结果。

问5：请问您都用什么方法筛选过？是不是CE效率高？

罗老师答： 我几乎试过所有报道过的方法。譬如磁珠法、CE法、NON-SELEX，M-SELEX，SPR-SELEX，膜法，PAGE-SELEX等等。CE效果还可以。曾经用SA做靶，实现过CE一轮看到复合物峰。7月底和国内的CE专家，本群的群友之一，石蕊-CE，三轮筛选看到复合物峰。去年国庆期间，用磁珠筛SA，四天四轮，也筛到了。蛋白建议用磁珠筛选，比较简单。也是目前成功率最高的方法。 小分子难度相对较大一些，而且亲和力都不高。

问6：如果磁珠方法，靶物质应该有多变少还是逐渐增加？

罗老师答：当然是由多变少

问7：对于链霉亲和素磁珠分离单链，有什么好的方法可以最大限度的降低生物素化引物等小分子的影响，又能保证目的链不丢失或者损失最少？ （指降低生物素引物的影响）

罗老师答：我来说一下SA磁珠法制备单链的问题：单链制备的产率受两个因素影响，一是PCR的产率；二是磁珠分离单链的产率；PCR的产率通常都不高，20-30%；所以有很多是游离的生物素化的引物，建议先用PCR clean的纯化柱纯化一下，（我们用的是sangon的PCR clean试剂盒）。再用Sa磁珠分离。纯化柱一般都说回收100bp以上的链产率较高，我们试过对于80bp的DNA也没问题。 biotin-Sa的结合，在低盐条件下容易脱落。所以洗脱时如果只用20mM NaOH容易导致biotin链的脱落（参见文献1.   A. Paul, M. Avci-Adali, G. Ziemer, H. P. Wendel, Streptavidin-Coated Magnetic Beads for DNA Strand Separation Implicate a Multitude of Problems During Cell-SELEX. Oligonucleotides, (Sep 4, 2009).）。

1.罗老师推荐的关于单链制备的一篇综述：

C. Marimuthu, T. H. Tang, J. Tominaga, S.C. Tan, S. C. Gopinath, Single-stranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation. Analyst, (Feb 7, 2012).

2.下面这篇文章建议先将磁珠用NaOH洗一洗，避免洗脱单链是biotin链的脱落：

R. Wilson, Preparation of Single-Stranded DNA from PCR Products with Streptavidin Magnetic Beads. Nucleic Acid Ther, (Nov 2, 2011).

罗老师建议洗脱时，加入100mM的NaCl，50mM NaOH洗脱，维持足够的盐离子浓度，保证biotin链尽少脱落。

化学所方晓红老师组，以及谭蔚泓老师组，他们用200mM NaOH洗脱，道理也在于维持较高的盐离子浓度。

问8：那罗老师您觉得100mMNaCl，50mM NaOH和200mM NaOH洗脱，哪个方法更好一些？ 200mM nacl可以认为其实还是在模拟体内的环境。

罗老师答：这个建议自己比较一下，每个人操作不同，可能得出的结论也不同。

问9：成功率较高的方案罗老师觉得哪个更靠谱些啊？

罗老师答：磁珠是最简单的方法

问10：磁珠法筛选，文库与靶标在结合缓冲液中孵育后，怎么样洗脱能够多多的去除一些非特异性的ssDNA呢？还有Lambda Exonuclease来分离单链后可以通过那些方法知道分离的效果呢

罗老师答：1 去除非特异结合的方法就是多洗几遍，但也不能洗得过多，要保证留下的一定比污染的分子多才可能成功；2、Lambda Exonuclease来分离单链后可以通过变性PAGE电泳来检测。

问11：我在生工合成修饰的探针，变性胶电泳，发现2条带，应该是修饰不完全，有没有哪个公司合成修饰探针的质量好些呢？

罗老师答：可以考虑takara，如果不是想在这件事情上“反日”的话。我的一个惨痛教训：去年十月到12月，我们整个实验室毫无进展，原因是生工把引物合成错一次，污染一次。

我有个建议，对所有做aptamer的人。建议合成pool和合成引物不要在一家公司合成。这样会大大减低污染的概率。 譬如我在takara合成pool，在生工合成引物。 如果特别喜欢某家公司，一定要在一家公司合成的话，建议先合成引物，再合成pool。道理是避免pool对引物产生污染。

问12：那个适配子的片段都很短，那么会不会很容易污染PCR仪，并且很长时间的污染

罗老师答：污染是aptamer筛选过程中很大的问题。PCR仪不会污染，但实验环境中可能会有气溶胶污染。

问13：那如何解决呢？

罗老师答： PCR仪倒是没关系，因为扩增前后都是盖着盖子的。关键是环境中的气溶胶污染。 非常难以解决，做了很多尝试，也问了很多人，目前还是觉得很难。

一个方法是：物理上的空间隔离。另外，我们还有个方法，就是PCR mix批量配置，这样可以避免PCRmix配置过程中被污染的概率。

PCRmix -80或-70储存半年一年都没什么问题的。就是把PCRmix除了模板以外的部分都加号，混合均匀。分装成500ul或1ml一管，储存在冰箱。下次用到直接拿出来就可以了。

问14：罗老师的MIX是自己配置的吗

罗老师答：是的。如果不差钱，买配好的mix效果可能会更好。

问15： mix用的酶就是普通的Taq酶么

罗老师答：我用的多半是生工的pfu。不同的酶扩增效果有差异。最近计划试试biorad的PCR mix，不过还没到货。

问16：文献里说taq酶这种不是高保真的酶，可以增加库容的。

罗老师答：有人用其实库容很低的库，然后用易错PCR来做筛选。我觉得没必要这样来增加库容。aptamer筛选的库容足够大了。

问17：曾经用过pfu酶做分子实验，感觉这个酶对模板要求很高，

罗老师答：pfu和taq扩增的结果确实有差异。不过对于我们的使用来说，觉得没什么问题，也就没再仔细研究了。

问18：热启动酶怎么样呢？

罗老师答：我试过大约4家公司的热启动酶，感觉效果也没有太大的变化

问19：罗老师一般初始的库容量有多少？

罗老师答：10E15，差不多是1个OD做一次。

问20：对于固定系列，直接用文献里的可以吗？一般文献上给的适配子序列会不会是故意给错的呢？我们原来也用人直接用过文献里的序列，结果发现特异性及亲和性没文献里说的好，相差很远

罗老师答：一般不会的，要么不给，要么就给正确的。故意给错是学术不端行为，一般不会。但有可能给的不是最好的。试文献里的序列不好是有可能的，这不能作为文献给错的证据。有可能你的测试条件与他的条件不同。这也是很多人觉得aptamer不靠谱的原因，换个条件结合就不好了。这也是整个aptamer产业发展面临的障碍，如何获得高稳定性的aptamer。所以，大家才会看到，数百篇aptamer文章都在用thrombin的aptamer。

问21：罗老师，我还有个问题，每轮筛选之后洗脱下单链DNA之后您还对其进行了哪些处理，比如中和、浓缩等，具体的处理方法是怎样的？

罗老师答：一般文献都是中和，不过你需要小心计算中和的条件。保证中和完之后，条件与binding buffer相同。也可以透析，交换为binding buffer；也有用沉淀方法的。

问22：那磁珠的用量是恒定的吗

罗老师答：一般开始多一些，后面逐渐减少。

问23：蛋白磁珠筛选五轮少吗？

罗老师答：通常不够，新手建议至少筛选到十轮。如果看不到希望一定是哪里出问题了。

问24：那PCR扩增制得用于下一轮的文库量是怎么确定的呢？

罗老师答：如果第一轮1OD，第二轮最好在0.1OD以上 ，后面可以根据亲和力情况再缓慢减少。

问25：会不会筛丢，每轮筛选洗脱的东西都减少，感觉不到富集

罗老师答：筛丢当然是可能的，不然为什么失败率那么高呢？

问26：请问每一轮筛选后做pcr是不是应该增加循环数呢

罗老师答：是否需要增加循环数，取决清洗的程度，主要是留下来的模板量。 一般不建议增加循环数。

问27：模板量太少增加循环数有用吗？

罗老师答：要保证污染不要超过模板就行。

问28：请问鉴定PCR产物及单链文库您一般用的什么方法？

罗老师答： PAGE，和变性PAGE

问29：是鉴定单链的都要用变性的吗？

罗老师答：单链如果用PAGE胶，会有拖尾，无法判定。建议都用变性PAGE

问30：筛选时所谓富集会是产生模板量越来越多吗？

罗老师答：如果你能保证筛选过程中，洗涤条件完全相同的话，应该是这样的。

问31：如何鉴定是否已经被污染呢？

罗老师答：做无模板的PCR对照判断。

问32：那我筛选时模板量越来越少，会是什么问题？

罗老师答：可能是你清洗过于严格，导致留下的模板太少所致，得到的都是污染的东西。

问33：我每次筛选后做的PCR都用PAGE电泳检测，但好像条带位置都不对，不知是怎么回事？

罗老师答：如果是常规PAGE电泳是有可能的，产物会出现多个条带。你用变性PAGE就不会有问题了。

还有几个问题罗老师可能木有看到····（以下回答部分与10月4日整理时添加）

1. 看文献都是十几轮的，请问您有用什么方法四轮就可以有结果呢，靶蛋白起始量大概是多少呢？

答：磁珠法，要控制磁珠量尽可能的少。一般都要用到10E7，太少操作几遍就丢了，找不到磁珠。文献报道最少的是10E6个磁珠，我们能到更少。

2. 蛋白用什么固定呢？（磁珠法）

答：一般都是用NHS/EDC方法偶联，可以参考invitrogen的磁珠操作说明书。

3. 初始文库用1OD是筛选蛋白吗？

答：是的，1OD大约是10E15个分子。

4. 双链也用变性PAGE鉴定么？

答：可以的，如果两天链等长的话，就可以看到是一条带。如果用非变性PAGE，pool扩增产物通常会有多个条带，无法辨认。

罗老师推荐的书籍：国内原创的书，邵宁生老师的《生物文库技术》

北理工屈锋教授目前正在翻译《aptamer handbook》

罗老师对大家的一点建议：

多看文献，实时追踪最新进展；如果大家不知道如何追踪最新进展，请关注罗老师开设的《文献管理与信息分析》课程，其中RSS部分。

非常感谢罗老师的耐心解答~~

第二次交流时间：10月21日晚8点

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