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一不小心,又创新了。 精选

已有 2041 次阅读 2017-3-20 02:10 |个人分类:多重PCR技术|系统分类:科研笔记|关键词:生物技术 创新 创业

我们最近又申请了一个新的多重PCR专利,新技术叫dam-PCR (dimer avoided multiplex PCR).

凡是做过PCR的人都知道,当反应到最后的时候会形成系统饱和期(plateau),扩增产物就不再增加了。一般认为这是多聚酶被PCR产物占据,没有新扩增产物的原因。不过,绝大多数人可能不知道这个系统饱和其实是由两个部分组成的(上图),一部分是想要扩增产物,另一部分是背景扩增和引物双聚体(primer dimer)。在做多重PCR的时候也是如此(中图),有很多靶点是想要扩增的,但是在最后达到饱和期的时候,系统中通常更多的是引物双聚体。如果我们能避免引物双聚体形成(下图),在PCR反应达到饱和期的时候就有更多想要扩增的产物形成了。



所以dam-PCR要解决的问题就是避免引物双聚体的产生。我们在反应的早期就把引物和产物分离,把引物从反应体系中去掉,避免双聚体形成,从而提高了多重PCR的敏感性。dam-PCR除了提高了多重PCR的特异性很敏感性以外,还带来了另外几个好处:(1)定量能力增强,因为我们可以在第一轮反应的时候就给单分子加标记(unique molecular identifier), 这样扩增导致的偏差就能在测序后得到纠正;(2)多重反应设计和优化不再是问题,使得新产品,新应用的研发速度明显提高。(3)降低了测序成本。如果不去掉引物双聚体,至少30%的PCR产物是双聚体,在NGS测序的时候就会浪费掉30%的通量。所以有了dam-PCR做多靶点扩增NGS检测的成本就下降至少1/3.

下面是我最近在台湾讲课用的几张幻灯片:

最理想的多重PCR有上述几个要求:特异性,敏感性好,多重能力强,能定量,多个靶点间扩增均匀,使用方便,研发简单,速度快,价格便宜。dam-PCR的发明似乎满足了所有这些要求。不过,如果没有iCubate全自动技术平台,用手工做dam-PCR还是很麻烦的,因为要用磁珠做三次引物清除。

为什么多重PCR这么难做?首先,每个引物的设计都是一个挑战;针对每个靶点的每对引物扩增条件要协调;背景扩增要少;引物双聚体要避免。

针对每一个难关,我们(或者他人)都研发出了一些解决方案:(1)我们发现多聚酶针对不同的引物和模版有不同的亲和性,并开发出软件利用这个亲和性的不同来设计更好的引物。(2)针对多靶点之间扩增条件不兼容的问题,我们研发出了tem-PCR, arm-PCR等技术。(3)针对背景扩增的问题,韩国SeeGene公司有一个长引物扩增方法;(4)针对引物双聚体的问题,我们现在又有了 dam-PCR 技术。

在IT行业,有硬件,操作系统,应用软件的分类;相对应的,在生物技术领域也有硬件,系统软件,和应用三个档次。和普通PCR, qPCR, NGS 一样,多重PCR技术是一个平台技术。所谓平台技术就是能衍生出许多应用的,类似于系统软件的强大技术。

虽然高通量测序技术效力效率越来越高,多重PCR技术还是大有用武之地,因为测序技术本身不能解决分子诊断的核心问题:提高信噪比。把标本中所有的核酸都测序了,得到的毕竟大都是噪音。经过多重PCR技术做靶向扩增,能够突出临床需要的信号,滤去不必要的背景信号。有了强大的多重PCR技术,才会有更多的分子鉴别诊断产品出台。精准医疗,诊断为先。没有多重,就没有鉴别诊断,没有鉴别诊断,精准医疗就无从谈起。

说“一不小心,又创新了”,意思是这个发明来得很突然。一月份的一篇博客还在谈“赏酶”,强调生物技术创新应该在酶上面下功夫,现在又有新突破,是偶然中的必然?事情是这样的,我们在开发iPair+产品的时候,做单细胞测序,每个细胞的基因表达图谱都不同,于是多重PCR的引物使用率就不同,那些“没活干”的引物总是很快形成引物双聚体,占据多聚酶,导致多重扩增敏感性大大降低。我们本以为引物双聚体可以通过小心的引物设计来避免,结果发现双聚体的形成是几乎不可避免的。引物双聚体的问题,如果不去仔细研究(我们把单细胞测序过程中产生的引物双聚体做了NGS)就不知道这个问题的严重性,也就不会去设法解决这个问题了。使用dam-PCR技术以后,单细胞扩增测序的效果非常好。这个新发明具有巨大的商业价值,因为我们可以在这个平台技术上开发出许许多多的产品,所以我们也在第一时间申请了专利保护。

PCR技术被发明已经30多年了,我们还能从中找到这么多创新的机会,这让我庆幸之余也很茫然:是否还有很多我们忽略了的问题?是否还有更多创新的机会?都说机遇是给有心人准备的,可是我们专注于多重PCR的研究十多年了,为什么今天才注意到这个这么明显的(引物双聚体)问题?

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