3 细菌致病理论的建立——撰写“细菌学圣经”的人——Robert Koch

罗伯特·科赫(Robert Koch，1843—1910，图17），伟大的德国医学家，诺贝尔医学和生理学奖获得者。科赫生于1843年，1866年毕业于德国哥廷根大学医学院，获得博士学位。他毕业几年后暴发普法战争，他作为随军医生参军，于战争结束后到东普鲁士一个小镇(Wöllstein）做了卫生官员。1875年，他参观了德国许多伟大的科学研究中心，使他对正在新兴的微生物科学发生了浓厚的兴趣。当时，巴斯德发现了引起腐败的细菌，并由此提出的“微小生命体理论”正处于热烈的争论之中；李斯特发展的外科消毒技术正在推广应用；他的解剖学老师Henle正在为疾病是由生命体引起的观点进行辩护；但是，细菌致病的传染途径还不明确。在坚持临床实践的同时，他开始调查炭疽病的问题[27]。

图17 罗伯特·科赫(1843—1910）

3.1 第一个捕捉到病原菌的“猎人”

当时炭疽病在他的所在地肆虐，4年间杀死了528人及大约56000头牲畜，此时微生物学研究在世界上刚刚起步，没有人能解释疾病传播的原因。科赫对患病牲畜的血液进行仔细观察，找到了病原体炭疽杆菌，把这种细菌接种到小鼠体内，会使小鼠患病并且感染给其他小鼠，最后还能从小鼠体内重新得到和牛身上相同的细菌。他还发现这种细菌可以形成圆形的孢子，孢子具有致病能力而且能够存活很长时间。而且，他用血清在与牛体温相同的条件下在动物体外成功地培养了细菌。这是人类第一次用科学的方法证明某种特定的微生物是某种特定疾病的病原[28]。图18所示为科赫当时使用的显微镜和观察到的炭疽杆菌，及根据显微镜下观察到的炭疽杆菌不同形态的手工绘制的图。

图18 科赫当时使用的显微镜、显微镜下的炭疽杆菌及根据显微镜下观察到的炭疽杆菌不同形态的手工绘制的图 

3.2 创新细菌显微和分离培养技术——犹如“猎人”的身上插上了“翅膀”

科赫研究团队在研究炭疽杆菌和其他细菌的过程中，结合研究工作创立了一整套病原菌研究方法。科赫发明的用土豆片作为载体的细菌固体培养方法，是他对细菌学发展的又一重大贡献。在此基础上，他的博士后夫妇，Walther Hesse和他的妻子Fannie Hesse发现了一种熔点更高的琼脂作为固体培养材料。他的助手佩里(Julius Richard Petri，1852—1921，图19）设计了培养皿，从而能够在有菌条件下分离获得由一个细菌长出的“纯培养物”(单菌落）。

尽管当时克雷伯(Edwin Klebs，1834—1913）和李斯特已经发展了液体分离技术，但这种方法既耗时，又难以保证获得“纯培养”。图19所示为一直沿用至今的“琼脂”(植物胶的一种，常用海产的麒麟菜、石花菜等制备，产自海南而得名）的固体培养材料、Petri发明的用于固体培养的平皿，以及由此可以方便地分离获得纯的细菌。

图19 佩里(1852—1921）和现代实验室固体培养常用的平皿

同时，科赫实验室的科学家们，还发明了细菌的固定、染色技术，及“油镜”(在观察被固定在玻璃片上的细菌，再滴上几滴油，能够提高显微镜的观察效果），为病原菌的鉴定提供了保障。科赫还将显微拍照应用在细菌学的研究中。1882年科赫采用改进过的抗酸性染色法，成功发现了引起肺结核的病原菌，并用血清固体培养基成功地分离出结核分支杆菌，进而用实验阐明了结核病的传染途径，确认了结核菌是结核病的病原菌，该成果于1882年3月24日在德国柏林生理学会上宣布，成为结核病防治史上的里程碑事件[29-30]。1890年科赫提出用结核菌素治疗结核病，1905年发表了控制结核病的论文，并获得诺贝尔生理学或医学奖。

3.3 “科赫法则”——“细菌致病理论”的验证和完善

在科赫发现炭疽杆菌后，开始研究动物的创伤。由此，鉴定出了引起动物败血症、坏疽和脓肿的细菌各不相同，还阐述了同一细菌具有不同生理形态的“共性”。从而提出：对于感染疾病的研究，必须研究特殊的致病菌，才对能够认识这种疾病的发生。他根据自己分离致病菌的经验，总结出了著名的如图20所示的“科赫法则”：①具有相同症状的每一个病例中都出现相同的微生物，而健康者体内不存在该微生物；②能够从患病宿主分离出该微生物并在体外实现纯培养；③用该微生物的纯培养物接种健康而敏感的宿主，能够使健康宿主患同样的疾病；④从试验发病的宿主中能再度分离培养出这种微生物来(其中第④条为后人完善补充）。

图20  科赫法则过程演示 

如果进行了上述4个步骤，并得到确切的结果，就可以证明该生物即为该病害的病原物。“科赫法则”为人类的传染病研究与防治起到了不可估量的作用。在这个原则的指导下，19世纪70年代到20世纪20年代成了发现病原菌的黄金时代[27]，例如1883年科赫和同事一起在印度发现了霍乱弧菌以及阿米巴痢疾和两种结膜炎的病原体，1883年他的助手莱夫勒(Friedrich Loffler，1852—1915）发现了白喉杆菌，1884年加夫基(George Gaffky，1850—1918）发现了伤寒杆菌，1894年耶尔森(Alexandre Yersin，1863—1943）发现了鼠疫杆菌[28]。表1列出了1877—1906年间科学家们发现的20种重要致病菌，这些致病菌的发现大大提高了人们对传染病的防治水平。科赫这样形容他发明的这套病原菌研究方法：“只要找到了正确的方法，发现就像从树上摘果子一样容易”。

表1  1877年—1906年期间发现的20种致病菌

在科赫研究生涯中的如此多的“第一次”中，其第一次分离获得的结核分枝杆菌，在两周后证明是造成肺结核的致病菌，这是被世界认为是“振动世界的事件”。1882年3月，科赫在德国生理学会会议上有关发现结核分枝杆菌的报告，被称之为至今医学史上最有影响力的报告。在与会的200多位学者中，后来发明“魔弹”的保罗·埃尔利希(Paul Ehrich，1854—1915）深受科赫的感染，他着手改进了科赫的细菌染色方法，并由此影响了丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰(Hans Christian Gram，1853—1938，图21）等，从而诞生了革兰染色法。最初革兰染色法是用来鉴别肺炎球菌(革兰阳性菌）与肺炎克雷伯菌(革兰阴性菌）之间的关系。图21所示为用革兰染色后能够清晰地区分革兰阳性菌(蓝色），与革兰阴性菌之间的差别(红色）。染色后细菌与背景形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定，其原理是两种细菌的细胞壁(膜）结构组成不同，造成对染料的着色差异。

图21 汉斯·克里斯蒂安·革兰(1853—1938）(A），革兰阳性菌(B）和革兰阴性菌(C）

科赫有关结核病的病因学文章随后发表，从而成为享誉世界的伟大科学家。他的发现得到了美国的敬仰，从而在1904年成立了国家结核病协会。科赫本人于1905年获得诺贝尔奖。图22所示为科赫根据显微镜下观察情况，手绘的肺结核杆菌围绕着一个巨大的细胞的形态，以及至今仍然保存在英国伦敦皇家外科学院亨特博物馆的第一次分离获得的结核分支杆菌。由此，诞生了以链霉素为代表的抗结核病药物，使19世纪以来的传染病得到了有效的控制。图23所示是为科赫制作的卡通，图题为New St.George(一位新的圣·乔治；寓意为英国的守护神）：手里高高举起的是他研究的重要武器，显微镜；马鞍刻写的是“研究”两字；他正在与结核分枝杆菌进行战斗的场景。

图22 围绕着细胞的结核分枝杆菌的手绘图(左）及保存至今的第一次分离获得的结核分枝杆菌(右）

画像中马鞍刻写的是“研究”两字，他正与结核分枝杆菌进行战斗，他手中的剑是显微镜

图23 科赫被称为“圣乔治”(德国报纸Ulk 1890年11月14日版第8页） 

虽然以现在的科学发展看，“科赫法则”的具体方法并不适用于所有病原微生物，例如最近暴发感染的冠状病毒SARS-CoV-2，它没有细胞结构，不能像细菌或真菌那样在体外实现纯培养[31]。不断涌现的生物化学、分子生物学、组学研究等技术更新了传染病和病原菌研究的具体方法，但“科赫法则”的基本精神仍然是不可违背的，要想确定某种传染病的病原生物，必须能从患者或疑似患者体内鉴别出病原微生物，并且需要证明这种病原微生物确实能够导致该种传染病[32]。1897年以后，科赫提出每种病都有特定病原菌的理论，纠正了当时认为所有细菌都是一种的观点，从而兴起了病原学研究，与巴斯德一起，为创立“细菌致病理论”做出了决定性的贡献。作为世界上第一个确认传染病是由细菌感染而导致的科学家，科赫无疑是病原细菌学的开拓者。

4 巴斯德-科赫之争

巴斯德与科赫是“细菌致病理论”形成的两位最重要的科学家。巴斯德创造了独特的玻璃烧瓶，细长的瓶颈弯曲向下，使得空气能够进入容器，但阻止了空气中的颗粒飘落到烧瓶中，说明空气内确实含有微生物，是它们引起有机质的腐败，从而证实发酵是由微生物引起的，彻底否定了“自然发生”学说；他首次制成了狂犬疫苗，并揭示和证实了免疫学说。巴斯德确信微生物会导致人类疾病，这是他的卓越贡献，但他从未将一种微生物与疾病直接联系起来，科赫则成功做到了这一点。科赫在微生物学基础操作技术方面发明了培养微生物的固体培养基划线纯培养法以及染色观察、显微摄影技术，开启了病原菌的分离、培养、鉴定的先河，证实了炭疽杆菌、结核杆菌是导致各自疾病的病原，提出了著名的 “科赫法则”，使得微生物学作为一门独立学科开始形成。

巴斯德和科赫以及科赫的同事之间曾产生了一场激烈的争论，起因是后者对巴斯德关于减毒疫苗的工作提出了严厉的批评。科赫认为，巴斯德在发现病原菌和发展感染疾病研究方法方面不够稳妥，其最新发布的两项工作中存在方法错误，而错误的方法导致了错误的结论，这些方法不符合科赫认为研究病原菌所必须的原则。而且，由于他接种的细菌是混合物，而不是纯种，其选择的动物也不合适，因此，巴斯德的方法和结果是不可信的。事实上，科赫与巴斯德之间产生了尖锐的争论，在日内瓦召开的国际卫生会议上成为了一个焦点。科赫的批评主要刊登在了1883年1月18日的波士顿医学和外科杂志上，而1月20日的《科学革命》载有巴斯德对科赫批评其方法和结果的答复，这些方法和结果涉及疾病微生物和减毒病毒用于接种的价值。

诚然，再正确的科学发现，在当时都难以做到让每个人都接受，而科学家之间的辩论，往往也无法完全脱离各自的国家、民族、教育等背景。例如巴斯德是法国人，而科赫是德国人；巴斯德开始是一位化学家，但在微生物科学中具有广泛的哲学兴趣，而科赫本职工作是医生，对微生物致病的原因(特别是细菌）感兴趣。当巴斯德在研究通过免疫预防传染的时候，科赫在研究通过卫生和公共健康预防传染；巴斯德通过他的助手Thuillier去德国演示他的炭疽接种技术，结果取得成功，并被德国接受时，科赫指责巴斯德的炭疽减毒疫苗使用的不是纯炭疽杆菌，因而这样的接种研究是错误的。Thuillier写道：科赫不像他的同事，有点像“乡下人”，巴斯德说科赫听不懂“议员的语言”，而科赫认为：巴斯德不是医生，我们不能接受他对疾病症状和病理学过程的判断。

科赫-巴斯德之争既伤害了双方，也有利于双方：尽管这样的争论，导致法国推迟了科赫发明的培养技术，德国推迟了应用巴斯德发明的狂犬疫苗，但法国和德国的竞争，强烈的渴望获得科学成就的最高荣誉，最终获得了无可争议的成就，这些成就将比仇恨更长久。