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光催化降解大肠杆菌操作流程

已有 4813 次阅读 2011-4-21 14:56 |系统分类:科研笔记

光催化降解大肠杆菌操作流程:     平时操作时可以从第六步开始

1.    LB培养基配置(无色)5.5g NaCl, 5.5g 蛋白胨,2.75g 酵母粉溶于550 ml去离子水中(1000 ml量筒称量),搅拌。之后加入8% NaOH调节PH7.0-7.2之间(pH试纸为6-8的调节)。然后,将其分别装在5250 ml的锥形瓶中(100 ml)和一个50 ml的锥形瓶中(25 ml左右即可)。然后用纱布(5楼)将上述锥形瓶瓶口堵住,最后再在外面包2层报纸,用细绳系上。

2.    将上述6个瓶子放在杀菌锅中121°20 min杀菌。(操作:将杀菌锅内添水,使水位不要高于探头,将6个瓶子放入锅内,之后将锅盖盖上。将放气阀打开,当温度升至101.4°左右稳定后,再将放气阀关闭。直到121°20 min后。然后将杀菌锅开关关闭,待压力降低到0时,再将放气阀打开,最后将锅盖打开)。

3.    E.coli接种(5E.coli代号:PET28a,平时放在4°的冰箱中保存,用锡纸将其包裹住)在LB培养基内:先将菌宝从4°的冰箱中拿出来(菌宝形状类似于小棉球一样,一个一个分散开。也有的类似于浑浊的液体一样,菌宝不能确定菌落的个数,只能确定ODoptical density)值),然后在无菌台上面进行操作。0.03 g KANAMYCIN抗生素将其溶于1 ml H20中(用1.5 ml的小管(紫外灯灭菌后)承装),之后取25 ml(0.03g KANAMYCIN/1 ml H20)的溶液将其溶于装有LB培养基的25 ml锥形瓶中摇匀(注意移夜时要将枪头至于液体内部)。目的是防止其他菌种生长。上述在无菌台中的操作都是将紫外灯关闭,将酒精灯点燃。最后用接种棒(在酒精灯下煅烧一段时间)移出一小块菌宝于25 ml锥形瓶中,从而完成接种。

OD值:通过UV-VIS扫描确定,在波长为600 nm出的吸光度值就是它的OD值。OD值与菌落的个数(包括活的细菌+死的细菌)有着一定的数学关系。也可以通过做标准曲线进行测量

4.    将接种E.coli之后的25 ml锥形瓶放置在30°的摇床中12 h,从而使其达到对数生长期的稳定值(可以用OD值来监测)。另外5250 ml的锥形瓶中放在空气中即可。

5.    摇床12h之后,将25 ml锥形瓶取出来,然后在无菌台上面进行操作。首先取0.03g KANAMYCIN抗生素将其溶于1 ml H20中(用1.5ml的小管(紫外灯灭菌后)承装),之后分别取100 mL (0.03g KANAMYCIN/1 ml H20)的溶液将其分别溶于装有LB培养基的100 ml锥形瓶中摇匀(注意移夜时将枪头不要至于液体内部)。然后,从25 ml锥形瓶中分别取出3 ml菌液溶于上述的5100 ml锥形瓶中摇匀(将100 ml锥形瓶上的纱布塞子在酒精灯上烤一下-目的是杀菌,然后再外面包2层报纸,用细绳系上)。最后将上述接种E.coli之后的5100 ml锥形瓶放置在37°的摇床中3 h

6.    配置固体培养基:称取7g NaCl, 7g 蛋白胨,3.5g 酵母粉溶于700 ml去离子水中(1000ml量筒称量),玻璃棒搅拌。之后加入8%NaOH溶液调节pH7.0-7.2之间(用6-8pH试纸调节)。将上述所配的700ml LB培养基(上述液体)分别加入到7250ml的锥形瓶中,每个锥形瓶中装100ml LB培养基。然后,分别向上述的7个锥形瓶中分别添加2g琼脂粉(一般是100ml LB培养基对应2g琼脂粉),摇匀。最后将装有琼脂粉的7个锥形瓶(用纱布,报纸包裹好),石英反应器+磁力搅拌器(报纸包裹好),2个涂棒(报纸包裹好),0.9% NaCl生理盐水(将瓶盖用针头扎开--5楼,共四瓶生理盐水,平衡内部和外部气压),28个培养皿(用报纸包好,每7个包一包),自已移液枪的枪头(取反应溶液用,约20个),1.5ml的小管(60个),QYY(移液枪头,一盒黄色+一盒蓝色)XW的饭盒(用于装小管),1L容量瓶,烧杯3个(一个100ml—用于从1L容量瓶中称取100ml反应溶液,250ml—用于装生理盐水,涂板过程中清洗涂棒),放置于杀菌锅中121°20min杀菌。

当琼脂粉遇高温溶于LB培养基之后,再将其置于室温的条件下(将其放在平板培养皿中,一般20 ml可以涂抹一个平板培养皿),便会形成固体培养基;一般100 ml固体培养基能够涂抹4个平板培养皿。

7.    将上述接种E.coli之后的5100 ml锥形瓶取出,再取出8个灭菌后的离心管(50 ml5楼),将5100 ml锥形瓶中的菌液分别加入到8个灭菌后的离心管中离心(离心时需要配平),8000转离心5分钟。倒出上面的溶液,离心管下面呈现出灰色的粉体膜(这就是大肠杆菌宏观形态)。然后取出一个离心管再做分离离心实验,另外七个装有粉体膜形状的大肠杆菌放置在-80°的冰箱中保存,以便下次再用(519室冰箱,这样保存菌种可以保持6个月左右)。向取出的这个离心管内加入灭菌后的0.9% NaCl生理盐水洗涤离心3次(8000转,5min,确保生理盐水冷却,以防杀死大肠杆菌)。最后向离心好的装有灰色粉体膜的大肠杆菌离心管中加入10 ml 0.9% NaCl生理盐水作为涂版的原液(放置在5楼的搅拌器中,充分搅拌使其均匀混合)。

另外七个装有粉体膜形状的大肠杆菌放置在-80°的冰箱中保存,以便下次在用(519室冰箱,这样保存菌种可以保持6个月左右)。

8.    以下操作均在无菌台上操作:迅速将上述经过121°20min杀菌后的装有琼脂的7个锥形瓶(100ml LB培养基 + 2g琼脂粉)放置在无菌台上(4杨老师组),将酒精灯打开,然后将培养皿打开(左手拿培养皿,培养皿的大盖子在上面),右手将热的装有琼脂粉的LB培养基倒在培养皿中(纱布,筛子同时也用右手拿着),不断的摇晃培养皿,使其均匀平铺。当装有琼脂粉的LB培养基覆盖培养皿的体积达到一半时,停止加入。将培养皿放在平整的平台上,冷却。便得到了固体培养基。切忌制备固体培养基时,不要产生气泡。一般100ml固体培养基能够涂抹4个平板培养皿。

9.    光电催化降解实验:从1L容量瓶中取出100ml菌液(用灭菌后的100ml烧杯装),让后将烧杯中的100ml菌液倒入石英反应器中(内含搅拌子),将工作电极,对电极,参比电极,电化学工作站连接好(电极不需要灭菌),打开氙灯。每隔20min取样品一次,总共取到反应时间为80min每次取样用自己的移液枪取样(量程调为600uL,取两次共1200uL1.2ml菌液于灭菌后的1.5ml小管中。然后将小管移动至灭菌台中。

10.涂版1:将灭菌后的1.5ml的小管放置在小管架上(蓝色)共放置7个小管(分别标号-12,34567)。然后再分别称取900ml的生理盐水注入小管内(蓝色移液枪头),目的是起到稀释的作用。吸取100ml菌液注入1号小管中,反复吸--吸,然后充分摇匀,目的是使100ml菌液达到稀释10倍的作用。接下来再向1号小管中吸取100ml的溶液注入2号小管中,反复吸--吸,然后充分摇匀,目的是使100ml菌液达到稀释100倍的作用。同样道理,在最后的7号小管中的大肠杆菌的浓度为100ml原液的10-7倍。(这个过程原则上应该反复更换移液枪枪头,因为浓度从高到底吸取,防止污染)。当所有小管都充分摇匀之后,开始涂版。

11.涂版2:分别将上述浓度为100ml菌液10-310-5,和10-7倍的溶液吸取200ml,注入到固体培养基中(3个浓度对应3个培养皿,可以使用一个移液枪头从低浓度到高浓度吸取操作,黄色移液枪头),然后将涂棒在酒精灯下煅烧,再打开培养皿,将煅烧后的涂棒在培养皿的上盖上反复刮几次(目的是使其迅速降温,防止烫死大肠杆菌——更重要的是防止破坏固体培养基的形状,同时还可以去除上盖上面的水蒸气)。开始涂版,涂版的顺序是浓度从低到高的顺序进行(不用反复更换涂棒)。涂版的操作是:将载有大肠杆菌的培养皿打开(左手拿培养皿,培养皿的大盖子在上面),右手用涂棒涂板-先顺时针方向刮涂10圈,然后再逆时针方向刮涂10圈。接下来再将左手的培养皿旋转120°,重复右手过程。最后再次旋转左手的培养皿120°,重复右手过程。使其均匀分散开。最后将培养皿用封口膜封上,使其培养皿的大盖子应该在下面。 将起始的0min和反应时间为80min的菌液留下——目的是做SEM,TEM分析(具体的保存方法是:取750 uL的菌液与250 uL的甘油充分混合一起,将其放在-80°的冰箱中保存)。同时将反应时间为0min,20min,40min,60min80min的菌液收集,冷冻干燥后(得到粉末状的大肠杆菌)作FTIR分析。

12.然后重复上述过程,分别作反应时间为0min,20min,40min,60min80min的菌液。!!注意,对于不同反应时间的样品菌液,应该清洗涂棒——将涂棒放置在灭菌后的装有生理盐水的50ml烧杯中,清洗几次,然后再在酒精灯上面烧一下。最后开始涂板。

13.将上述接种大肠杆菌之后的固体培养基放置在37°的培养箱中培养12h此时,培养皿需要用封口膜封上,另外培养皿的大盖子应该在下面)。培养之后的大肠杆菌会生长在固体培养基表面。选择最适宜的大肠杆菌的浓度:就是在固体培养基中生长大肠杆菌的菌落数大约在5-20个之间。从而进一步推算原液中大肠杆菌的菌落数。

再得知原液中大肠杆菌的菌落数-我们可以配置108左右个菌落数的大肠杆菌作为光催化实验用的起始大肠杆菌原液浓度(可以配置多一些,比如1-2L用作光催化实验的原始大肠杆菌溶液,此溶液可以在4°的冰箱中保持3-4天左右,便于实验)。

14.催化剂和电极不用杀菌!

15.每次降解后取出大肠杆菌溶液1-1.2ml,以用作涂板计数!

16.首次试验发现:在接种大肠杆菌之后的固体培养基放置在30°的光照培养箱中培养16h之后,在10-7倍的溶液中观察到了12个大肠杆菌菌落(10-7倍以前的稀释倍数,大肠杆菌的菌落数太多不适宜观察;10-7倍以后的稀释倍数,大肠杆菌的菌落数太少没有观察到)。因此可以计算得到原液(10 ml)中的大肠杆菌群落数为12 * 107 * 100 (100 ul10 ml中取到)=12 * 109个大肠杆菌群落数(12 * 108 CFU/ml)。因此可以推断其他7个离心管中的大肠杆菌群落数大约也为109个(因为所观察到的质量差不多一样)。所以,光催化实验条件:将10 ml原液溶于1 L的容量瓶中配置成12 * 106 CFU/ml每次实验取菌液100 ml(可以做10)

17.-80°冰箱里取出来的大肠杆菌,先放在4°的冰箱中30 min,之后再取出放在室温下。(防止突然降温)

1L容量瓶中(光电催化)的菌液经过计算和涂板后得到的菌落数为12*106 CFU/ml(or 12*109 CFU)----起始菌落数。例:如果反应时间为20min所取的菌液,稀释10-5后的菌落数为6,则此时原20min的菌液数为6*105CFU (or 6*105*5 CFU/ml,因为当稀释到10-5时涂板过程中,所吸取的是200ul)


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