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神经科学的突破性方法:膜片钳技术 精选

已有 3041 次阅读 2020-8-15 16:55 |个人分类:科学史|系统分类:科普集锦| 科学史, 神经科学, 膜片钳

科学史:


神经科学的突破性方法:膜片钳技术

李升伟/编译

膜片钳技术最初是为了记录离子通过细胞膜通道蛋白的电流而发展起来的,现在它已经成为神经科学工具箱中真正的中坚力量。

大脑中的信息被认为是由数千个神经元细胞产生的复杂电脉冲模式编码而成的。每个脉冲,即动作电位,是由流经神经元膜的带电离子电流调节的。但是,这些离子是如何穿过神经元的绝缘膜的,多年来一直是个谜。1976年,埃尔温 • 内尔(Erwin Neher)和伯特 • 沙克曼(Bert Sakmann)开发了膜片钳技术,该技术明确表明电流是由膜中许多通道蛋白的打开引起的。尽管这项技术最初是为了记录微小的电流,但它已经成为神经科学研究电信号最重要的工具之一——从分子水平到神经元网络水平。

20世纪70年代,人们普遍认为流经细胞的电流是由于细胞膜上许多通道的打开而产生的,尽管其潜在的机制尚不清楚。那时,电流通常是用尖利的电极(一种尖端很细的移液管)刺入组织来记录的。然而,不幸的是,以这种方式记录的信号太吵了,所以只有通过组织的大的“宏观的”电流——由许多不同类型的通道调节的集体电流——才能被解决。

1972年,细胞间突触连接生物学的先驱伯纳德 • 卡茨(Bernard Katz)和里卡多 • 米里迪(Ricardo Miledi)从膜通道的宏观电流中推断出某些特性,但这是在排除了所有可能的混杂因素之后才得以实现的。问题是,宏观电流可能受到与通道活性无直接关系的因素的影响,如细胞几何形状和调节细胞兴奋性的调控过程。同样麻烦的是,对宏观电流特征的解释是基于对单个渠道活动统计数据未经验证的假设。尽管卡茨和米里迪做了仔细的分析,但是他们的结论是否正确仍然存在疑问。关键的数据是由内尔和沙克曼使用膜片钳得到的。

膜片钳技术从概念上来说相当简单。将一个直径较大的移液管压在细胞膜上,而不是刺入细胞。在适当的条件下,移液管的尖端与膜“结合”,形成一个紧密的密封。与使用尖锐电极相比,这大大降低了噪声,因为由移液管尖端包围的一小片膜与细胞膜的其余部分和细胞周围的环境是电绝缘的。

这样,科学家们第一次观察到了通过膜片中几个通道的微小电流。记录确认了关键的通道属性:当通道打开时,在电流痕迹中有一个台阶状的跳跃;当它们关闭时,有一个台阶状的回落到基线。现在可以确定细节,如通道的打开和关闭的统计数据,它们所介导的电流的振幅,以及触发通道打开的最佳刺激。借此工作,内尔和沙克曼获得了1991年的诺贝尔生理学或医学奖。

膜片钳的改进使得研究各种制备体中的通道成为可能,从而最终解决长期存在的问题。科学家们对验证20世纪50年代诺贝尔奖得主艾伦 • 霍奇金(Alan Hodgkin)和安德鲁 • 赫胥黎(Andrew Huxley)提出的动作电位生成模型特别感兴趣。现在可以直接检验模型的具体预测,方法是通过单个通道检查电流,并观察当通道的分子结构改变时电流的变化。最终,这个模型被证明基本上是正确的,并且目前仍然是计算神经科学家的黄金标准。

膜片钳的几个变体之一——全细胞结构——被一群神经科学家发现了,他们正在研究通道水平以外神经元中的电现象。为了实现全细胞记录,电极下的膜片被击破,使电进入细胞。与使用锋利的电极相比,全细胞膜片钳允许更准确的记录,更重要的是,对细胞的损伤更小。这使得在细胞水平上对协同过程的系统研究成为可能,例如通过调节分子来调节宏观电流,以及神经元中不同类型通道之间的相互作用。

图1.jpeg

在全细胞结构中,在细胞中形成的相对较大的开口也为化学物质进入细胞提供了途径,使染料能够得到配送用于观察复杂的细胞结构,并提取RNA用于基因表达分析。内尔小组通过向细胞中引入化学物质,同时跟踪细胞膜电学特性的变化,来检测细胞间信息传递的基础事件的先后顺序。

全细胞膜片钳被证明是研究体外保存的大脑切片中神经元和神经元网络的集体特性的理想工具。在处理更复杂的系统(如神经网络)的一个挑战是,可能的混杂因素的数量增加。沙克曼在20世纪90年代提出的解决方案是用两个或三个电极同时进行全细胞记录,这在一些人看来有些过分,因为可以用更少的电极连续记录来获得可比较的数据。然而,这样做的理由是,花时间设计近乎完美的实验,可以缓解后来在数据解释方面的困难,类似于卡茨和米莱迪所面临的困难。

因此,来自神经元不同部位的同步记录最终证实,动作电位始于主长神经元突起(轴突)的一部分,并传播回树突(接收其他神经元输入的簇状突起)。将电极置于突触连接的两侧,可以直接研究神经元之间信号传递的机制。此外,来自不同类别神经元的三重记录揭示了网络组织的特定基本原则。

膜片钳技术还被用来检测在更为自然的条件下的细胞活动。为了研究感觉刺激和运动在大脑中是如何表现的,必须在活体动物身上进行实验。然而,这种方法的挑战在于,最轻微的运动就能将电极从神经元中移除。由于电极和膜之间的紧密密封,全细胞膜片钳的结果是非常稳定的。因此,这项技术可以记录被麻醉的啮齿动物的树突和成对的神经元,甚至可以记录来自会走路和跑步的动物的信息。

可以论证的是,膜片钳记录仍然是研究大脑电信号最直接有效的方法。用这种技术获得的数据基本上代表了神经科学许多分支研究人员的基本事实,从理论工作者到开发治疗某些脑部疾病(包括癫痫和自闭症)药物的转化研究人员。

另外,膜片钳补充和丰富了现代的“光遗传学”技术,它可以利用光控制和可视化大量神经元的活动。新兴的技术,如用于视觉的假眼,可能会严重依赖于膜片钳记录来建立将外部刺激转化为电信号的最佳条件。在可预见的未来,膜片钳技术显然仍将是神经科学家的重要工具。

 注:此文发表于《世界科学》2020年第2期,原文来源:Nature,有删改。




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