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提高血液病毒NAT通量、灵敏度和特异性的思考

已有 5398 次阅读 2013-6-15 12:47 |系统分类:科研笔记| 灵敏度, 特异性, NAT, 血液病毒

   

   临床应用中,对于血液病毒核酸检测(Nucleic acid testing)的原理是利用核酸扩增技术把已有的病毒基因组拷贝倍增,然后通过常规技术检测。理论上,单个目的基因分子即可被扩增检测出来,由于其高灵敏度性,大大缩短了临床检测的窗口期,近年来应用发展迅速。提高检测通量对于检测的人力物力以及时间成本的节约很重要,也能及时地使样本得到有效的处理;提高检测的灵敏度和特异性,可以保障检测的结果的准确度,从而更有效地控制病毒的扩散和传播,并预防疾病的发展恶化。NAT技术的发展对于公共健康十分重要。下面是我个人对于NAT技术的通量、灵敏度以及方法上的浅显的思考。

 

通量

无论是临床上还是实际检测中,病毒种类和病毒基因均相对十分有限,血液病毒NAT检测突破通量问题的关键在于在各个检测阶段增加样本处理量。

除了已有的通过混合样本检测但牺牲灵敏度的提高通量,以及通过集中处理两种提高通量的常用手段外,血液病毒NAT解决通量的问题,可以在NAT的三个阶段入手:核酸提取目的片段倍增、以及目的信号检测

第一个阶段,可以借助目前在核酸提取研究中获得的技术进展(包括已经商业化的成熟的设备) (Kim et al., 2009; Price et al., 2009; Zhang et al.,2012),结合NAT的实际,耦合提高后者的通量,这一步提取的核酸是NAT核心又关键的一步,核酸质量是后续测试灵敏度的基础和保障。虽然将现有的自动化的核酸提取设备,将能在一定程度上提高通量,但是缺少耦合加入中间的人工耦合操作环节,势必会使灵敏度有一定幅度的打折。因此,将高通量的核酸提取技术融入自动化NAT的检测是未来的趋势(Wang et al., 2012)

目的片段倍增和目的信号检测两个阶段,则可以分别借鉴现有的核酸扩增技术(Ahmad and Hashsham, 2012; Chang et al., 2012; Zhanget al., 2006; Zhang and Ozdemir, 2009)Microarray (Fournier-Wirth and Coste, 2010;McLoughlin, 2011; Miller and Tang, 2009; Volokhov et al., 2011)两大技术的研究进展进行自动化程度和通量的提高。

对于这些新兴技术的开发和应用,由于设备和试剂的高成本,集中处理检测对于高通量技术应用显得十分必要。

 

灵敏度和准确度:

提高NAT的灵敏度,可以从样品质量保障检测技术两方面入手。

样品质量保障上,可以通过增加单一样本的取样次数,以及增加单一取样的测试次数。当然实际的应用中,这样操作的前提是高通量的实现。另外,由于核酸的不稳定性(尤其是RNA),样品的储存和样品处理过程中的抑核酸酶技术,以及低温操作防止病毒核酸降解对于灵敏度的提高也是很重要。

检测技术上,增加检测探针和扩增引物的特异性。比如针对同种病毒不同亚型的检测,以及一大类病毒的检测,我们要采取不同的检测策略,比如前者针对各亚型特异性基因序列位点设计探针和扩增引物,而后者则针对所有亚型共同的保守区域设计探针。另外扩增反应的特异性也可以通过调节扩增反应的物理化学条件(包括温度、浓度、离子强度等)来实现。

当扩增了大量的特异性目的片段,保障目的性片段被选择地检测也是提高灵敏度的关键。在扩增过程中,新扩增出的目的片段被具有荧光信号或者用于后续检测的化学分子标记是常用的手段。而且,这些扩增出的特异性目的片段可以通过电场分离、柱分离、毛细管分析、与免疫技术结合以及特异性探针的杂交(如Microarray)来实现,这些技术的优化(包括分析、反应条件)也是提高灵敏度的途径之一。

另外,在NAT操作的各个环节,尽量避免和排除交叉污染对于保证准确度也十分重要。

某些情况下,加内标或者外参照,以及利用其它检测技术(比如Enzyme immunoassaysNorthern blotting 等)交叉确认对于NAT的准确度也十分必要。

应用和实际发展中,根据成本的控制、地域性的差异以及时间要求,我们可以综合采取单一或者多种策略来对准确度和通量需求进行保障。

 

参考文献:

Ahmad, F., Hashsham,S.A., 2012. Miniaturized nucleic acid amplification systems for rapid andpoint-of-care diagnostics: A review. Analytica Chimica Acta 733(0), 1-15.

Chang, C.-C., Chen,C.-C., Wei, S.-C., Lu, H.-H., Liang, Y.-H., Lin, C.-W., 2012. Diagnostic Devicesfor Isothermal Nucleic Acid Amplification. Sensors 12(6), 8319-8337.

Fournier-Wirth, C.,Coste, J., 2010. Nanotechnologies for pathogen detection: Future alternatives?Biologicals 38(1), 9-13.

Kim, J., Johnson, M.,Hill, P., Gale, B.K., 2009. Microfluidic sample preparation: cell lysis andnucleic acid purification. Integrative biology : quantitative biosciences fromnano to macro 1(10), 574-586.

McLoughlin, K.S., 2011.Microarrays for Pathogen Detection and Analysis. Briefings in FunctionalGenomics 10(6), 342-353.

Miller, M.B., Tang,Y.-W., 2009. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications inClinical Microbiology. Clinical Microbiology Reviews 22(4), 611-633.

Price, C.W., Leslie, D.C.,Landers, J.P., 2009. Nucleic acid extraction techniques and application to themicrochip. Lab on a chip 9(17), 2484-2494.

Volokhov, D., Kong, H.,Herold, K., Chizhikov, V., Rasooly, A., 2011. Oligonucleotide Microarrays forIdentification of Microbial Pathogens and Detection of TheirVirulence-Associated or Drug-Resistance Determinants. In: Khademhosseini, A.,Suh, K.-Y., Zourob, M. (Eds.), Biological Microarrays. Vol. 671. Humana Press,pp. 55-94.

Wang, J.-H., Wang, C.-H.,Lee, G.-B., 2012. Sample Pretreatment and Nucleic Acid-Based Detection for FastDiagnosis Utilizing Microfluidic Systems. Ann Biomed Eng 40(6), 1367-1383.

Zhang, C., Xu, J., Ma,W., Zheng, W., 2006. PCR microfluidic devices for DNA amplification.Biotechnology advances 24(3), 243-284.

Zhang, R., Gong, H.-Q.,Zeng, X., Lou, C., Sze, C., 2012. A Microfluidic Liquid Phase Nucleic AcidPurification Chip to Selectively Isolate DNA or RNA from Low Copy/SingleBacterial Cells in Minute Sample Volume Followed by Direct On-Chip QuantitativePCR Assay. Analytical chemistry 85(3), 1484-1491.

Zhang, Y., Ozdemir, P.,2009. Microfluidic DNA amplification—A review. Analytica Chimica Acta 638(2),115-125.




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