3D打印超高精度支架实现纯支架结构调控细胞生长

摘要：常规3D打印聚合物，精度只能控制在100-200微米量级（主要指打印出的纤维直径），考虑到细胞的尺寸在10微米左右，如果打印一个生物支架，100微米粗的柱子对10微米尺寸的细胞就有点像一座大山，细胞爬满整个支架的效率很低。如果将支架丝径降到接近乃至小于细胞尺度，会有什么有趣的现象呢？我们引入了近场直写打印方法，打印了异质支架（可控直径、可控密度、可控硬度），所打印的异质支架丝径可从3微米-50微米可控，用这个支架，我们研究了细胞与支架的相互作用，发现了细胞可以像竹子一样定向生长，随着结构的变化，细胞在支架上有多种未见报道的现象。

作为细胞的载体，组织工程支架被广泛应用于三维细胞培养。而支架与细胞的相互作用也在组织工程领域引起广泛关注，支架的刚度、孔径等因素会显著影响细胞的粘附、增殖、分化等。而传统的3D打印支架由于纤维直径远大于细胞尺寸，无法产生上述的相互作用；具有超细纤维的静电纺丝支架则由于纺丝过程不可控，只能获得均匀结构。浙江大学贺永教授课题组提出了一种基于近场直写的力学强度可调、丝径与孔径可控的非均质支架（MEWHS），通过调控支架结构诱导细胞的特定生长。

区别于传统的静电纺丝（纤维不可控）与熔融沉积的3D打印（纤维直径太大），近场直写技术能够实现超细纤维（几微米到几十微米）的可控沉积。通过对近场直写路径的规划，可以调节支架各部分的孔径大小，调节细胞的粘附与生长速度。由于近场直写获得的纤维与细胞大小相仿，细胞的粘附将对纤维的直径变化非常敏感。通过对打印过程中各项参数调控，纤维直径能快速变化，辅以粗细纤维的特定排布，细胞在支架上将呈现不同的生长形态。

图 1. 非均质支架原理示意图

不同细胞具有不同大小与形态，即使在同一支架上也会呈现不同形态。如BMSCs（骨髓间充质干细胞）通常能伸长超过100微米甚至200微米，而HUVECs则通常小于100微米。在孔径为200微米的支架上，BMSCs会直接跨过孔隙，在纤维之间“搭桥”，而HUVECs则会沿着纤维粘附，先把方孔围城圆形，再渐渐填满。

图 2. 不同尺寸细胞在支架上的形态差异

利用近场直写的可控沉积，制造的支架可以具有不同的孔径与孔隙形状，为之后更深入研究细胞-支架相互作用提供可能。在实验中，接种了HUVECs的非均质支架，不同区域的细胞数量在第7天有了明显的区别。

图 3. 孔隙不同的支架与细胞增殖的差异

研究人员探索了对纤维直径产生影响的多种因素，最后选择速度作为打印过程中控制直径的主要变量，实现在均匀的孔径下实现支架的非均质特性。在这种情况下，支架的不同区域具有不同力学强度，在不同方向的受力作用下，将产生不同程度的变形。通过更细致的直径调控，粗细纤维能组成复杂图案，如五角星、太极、求是鹰的图案（细纤维肉眼观察比粗纤维更透明）。

图 4. 可控的纤维形成的具有不同力学强度与图案的支架

纤维直径不同也会对细胞粘附产生影响，细胞在接触粗纤维时更倾向于整体粘附与粗纤维表面，以圆形方式填充孔隙；而在接触细纤维时细胞则更倾向于以一端缠绕细纤维，进而形成“搭桥”。由此，细胞在特定排布的粗细纤维上，产生了明显的定向生长趋势。

图 5. 细胞在特定粗细纤维排布上产生的定向效果

图6 课题组所产业化的高精度生物3D打印机EFL-BP5800

本研究提出了一种非均质支架，并提供了通过设计特殊支架结构来诱导细胞生长的策略。借助于高精度的非均质支架，科研人员将能够更好地模拟体内复杂的环境。

相关论文“Structure-induced cell growth by 3D printing of heterogeneous scaffolds with ultrafine fibers” 已被Materials & Design录用。

DOI：10.1016/j.matdes.2019.108092