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公布若干有关电磁场对神经细胞影响的研究进展(之三):工频电磁场对皮层神经元瞬时外向钾电流的影响

已有 5839 次阅读 2009-8-8 08:55 |个人分类:生活点滴|系统分类:科研笔记| 膜片钳技术, 瞬时外向钾电流, 生物效应, 神经元, 工频磁场

工频电磁场对皮层神经元瞬时外向钾电流的影响

1.引言

随着现代科技的进步和社会经济的迅猛发展,各种电子产品、电力设备被大量的应用到人们生活环境中,人为产生的电磁场已逐渐成为威胁人体以及其他生物体健康和安全的环境污染因子。电磁辐射污染,又称电磁污染,已成为继大气污染、水污染和噪声污染后的第四污染[1]。工频电磁场(power frequency electromagnetic field)是由输电线及家用电器所产生的一种极低频电磁场,我国采用50Hz为工作频率,而西方一些国家(如美国、加拿大)使用60Hz

人类接触这种极低频电磁场的机会远远多于其他频段的电磁场和天然磁场,有研究表明,极低频电磁场可能与肿瘤、胚胎畸形以及神经、心血管、免疫、内分泌、生殖等器官系统的病变相关[2]。极低频电磁场暴露能增加肿瘤(尤其是白血病、脑瘤和乳腺癌等)发生的危险度[2],在一定程度上具有促癌效应[3];细胞分子水平上的很多研究提示,环境中的极低频电磁场可能具有潜在的生物学危害[4];但是也有相当一部分研究结果对此持否定或矛盾的观点[5]。工频电磁场暴露可导致小鼠精子数量、活力下降,精子头部畸形率上升[6];50Hz正弦磁场暴露引起鸡胚畸形率增加[7];50Hz,0.5mT正弦磁场暴露可引起鼠胚胎细胞DNA双链断裂,卵裂速度明显下降[8]0.4 mT工频磁场长时间辐照可以使人晶状体上皮细胞DNA 双链断裂增加[9]。但也有报道称,人血细胞暴露于50 Hz、l mT磁场中48 h,DNA无损伤[10]。目前多数的研究还局限于肿瘤和生殖方面的调查研究,而对神经系统研究的比较少,仅有一些工频电磁场对大鼠记忆力的影响[11,12],以及工频磁场能够造成大鼠脑组织的脂质过氧化,尤其是基底前脑和额皮质部位[13]的研究。
经过多年的研究发现极低频电磁场能通过诱导细胞膜受体的聚集、降低膜的流动性和导电性、改变膜的结构等干扰细胞信号超导[3,14]。实际上,在许多病理状态下,都有细胞膜势能的改变,膜的结构组织上出现的变化导致了细胞膜极性的翻转等。现阶段磁场生物效应没有明确的理论基础,很多对于此方面的原因的研究都处于假设阶段 [15-18]现已发现许多脑部疾病与钾通道特性改变有关,研究工频电磁场对中枢神经细胞膜钾离子通道特性的影响,有可能为电磁场直接作用于脑组织引起某些脑部病变的机理起指导作用。鉴于电压门控K+通道在调节神经细胞膜兴奋性及神经可塑性中起着关键作用,本文利用膜片钳实验技术,研究50Hz工频电磁场对小鼠皮层神经元瞬时外向钾通道特性的影响,为从细胞和分子水平探索50Hz工频电磁场的生物刺激效应开辟了一条新的道路,为人们研究极低频磁场对神经系统的影响提供依据。
2.材料与方法
2.1. 材料
动物:昆明小鼠,鼠龄10~13天,雌雄不限,由中国医学科学院放射医学研究所提供。
试剂:链霉蛋白酶(Pronase),Merck公司产品。河豚毒素(TTX)、氯化镉(CdCl2)、氯化四乙胺(TEA-Cl)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、已二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)、Na2ATP均为Sigma公司产品。其余为国产分析纯。
(1)人工脑脊液(ACSF, mmol/L):NaCl 134,KCl 5,NaH2PO4 1.5,MgSO4 2,CaCl22, NaHCO3 25,Glucose 10,HEPES 10,pH7.4;使用前通氧气饱和。
(2)K通道标准细胞外液(mmol/L):NaCl 130,KCl 5.4,CaCl2 2,MgCl2 1,Glucose 10,HEPES 10,pH7.3,使用前通氧气饱和;
(3)K通道电极内液(mmol/L):KCl 120,CaCl2 1,HEPES 10,EGTA 10,Na2ATP 3,MgCl2 2,pH7.2,经0.22滤膜过滤。
2.2. 小鼠大脑皮层神经元急性分离
取出生10天左右的昆明小鼠迅速断头取脑,置于4°C人工脑脊液中,一分钟后将脑切成冠状切片,并继续切取皮层组织,厚度约为400左右,放入连续通95%O2+5%CO2混合气的人工脑脊液中,孵育50分钟。之后加入Pronase,其终浓度为0.36g / L,32°C下消化15min。消化结束用人工脑脊液洗脑片3次,加入盛有人工脑脊液的离心管中,用4根口径渐小的Pasteur吸管轻轻吹打组织块,制成细胞悬液,静置5min后取上部细胞悬液,放入带有盖玻片的培养皿内,约15~20min后细胞贴壁。分离完整的皮层神经细胞显微镜下观察,形态呈锥体或椭圆形,顶树突和轴突完整,细胞表面光滑,颗粒均匀细腻,它可在6~8小时内保持良好的生理状态[19,20]
2.3. 全细胞膜片钳记录和数据分析
在20~25°C室温下,利用PC2C膜片钳放大器(华中科大仪博生命科学仪器有限公司,中国)进行全细胞膜片钳记录,实验参数的设置、数据采集和刺激方式的施加均通过PC2C膜片钳自带软件来控制,采样频率为100kHz。记录用玻璃微电极(中科院电子所生产)经05-E型程控玻璃微电极拉制仪两步拉制而成,充灌电极内液后,电极阻抗为2~5ΜΩ。当电极与细胞膜之间形成高阻封接(>1GΩ)后,将钳制电位调到-80mV,进行快电容补偿后,稍加负压破膜,使电极液与细胞内液相通,再进行慢电容和串联电阻补偿,串联电阻补偿为60%~80%。
实验所用刺激装置由实验室自行研制,由自制圆形线圈外接交流稳压电源的形式产生2mT、50Hz磁场,通过改变线圈中电流的大小来改变线圈中心磁场的大小。先将小鼠的皮层神经细胞分离和贴壁,而后再将得到活性状态较好的细胞放置于工频电磁场当中,刺激后在进行膜片钳试验,最后将得到的数据和正常的进行对比研究,刺激过程如图1所示。
1 工频电磁场刺激示意图
Fig. 1 Schematic diagram of pulsating magnetic fields irradiation
实验结果分析采用Pclamp软件和Origin7.5统计软件完成,分析结果用Mean±SD表示,脉冲磁场刺激前后差异的显著性用单因数方差分析和检验进行分析,P<0.05表示有统计学差异。
3. 结果
3.1. 瞬时外向钾通道电流(IA)的记录
采用上述标准细胞外液和电极内液,且在外液中加入1 TTX、0.1的CdCl2和20的TEA-Cl,记录皮层神经细胞膜上外向钾电流。置钳制电位于-80mV,给予脉冲幅度为-60mV~+50mV,脉冲宽度60ms,步幅+10mV的去极化脉冲刺激电压(图2A),由于刺激频率与电流的强度大小没有直接关系,因此此次实验采用统一的刺激频率为0.25Hz,对得到的数据进行处理。该激活的外向电流即为快速激活和失活的瞬时外向钾电流IA(图2B)。
(A)
    
(B)
      
(C)
 
图2 (A)刺激脉冲 (B)记录的IA (C)曝磁后的IA
Fig. 2 Transient outward potassium current traces
(A) Depolarizing steps (B) Transient outward potassium current traces
CTransient outward potassium current traces after magnetic fields’ exposure
考察正常皮层神经细胞IA电流随时间变化的特点。给予图2A所示的去极化脉冲刺激,分别在1~6min记录不同时间的IA,可知IA在4min基本达到稳定。本试验分别采用加刺激与并未加刺激细胞第四分钟的IA电流进行比较。
3.2. 工频电磁场刺激对IA时间依赖性的影响
由于钾通道具有衰减(Rundown)现象,需要进行时间依赖性考察。给予与3.1相同的去极化脉冲刺激,分别对磁场照射15min和30min的IA进行记录,已知IA在4min基本达到稳定,数据记录应该从此时刻开始进行。为给予不同阶梯去极化脉冲刺激,经磁场作用15min和30min后的IA电流密度的曲线。由实验结果可知:细胞经过曝磁后,IA受到明显的抑制,对照组的最大电流密度为205.53±26.95pA/pF (n=9, P<0.05),15min照射组最大电流密度为81.68±9.15pA/pF(n=9, P<0.05) ,30min曝磁组的最大电流密度为43.57±5.59pA/pF(n=9, P<0.05)。
3 IA随时间变化曲线
Fig.3Effects of magnetic field irradiation on transient outward potassium currents in different irradiating time. Activation potential of transient outward potassium channel began to shift towards more negative potentials after irradiating for 15 min and 30min (n=9)
3.3.工频电磁场对瞬时外向钾电流I-V曲线的影响
给予同3.1中相同的刺激方式,将未加刺激和加工频电磁场刺激30min后得到的瞬时外向钾电流数据加以比较,以不同膜电位(去极化刺激电位)为横轴,该膜电位下激活的IA电流密度值(电流/膜电容)为纵轴,绘制通道电流的曲线(图4)。对照组和曝磁组的最大激活电流密度分别为205.53±26.95pA/pF,43.57±5.59pA/pF。由I-V曲线可知,经检验,对照组和工频电磁场刺激组IA在统计学上具有显著性差异(n=9, P<0.05)。
对照组、曝磁组IA曲线
Fig.4 Transient outward potassium currents difference between the control and magnetic field irradiation
3.4. 工频电磁场对IA稳态激活特性的影响
置钳制电位-80mV,预置-120mV超极化条件刺激200ms,然后给予脉冲幅度从-60mV~+50mV,脉冲宽度60ms,步幅+10mV的去极化测试脉冲电压刺激,引出一系列瞬时外向钾电流,以第四分钟纪录的瞬时外向钾电流作为对照。以本文前述方法磁场照射细胞,照射时间30min,再次记录上述电流,利用公式将电流值转换成电导值,其中G为电导、为测试膜电位,为翻转电位,为不同膜电位下测定的电流峰值。以电导值与最大电导值的比值对应膜电位分别绘制工频电磁场作用前后IK的稳态激活曲线(图5)。所得曲线可以用玻尔兹曼(Boltzmann)方程拟和,其中为半数激活电压,为曲线的斜率因子。由图5可以看出对照组与工频电磁场组激活曲线均呈S型,并由此计算出对照组和磁场照射组瞬时外向钾通道的半数激活电压分别为19.96±2.87mV和8.12±1.67mV(n=9, P<0.05),斜率因子分别为22.28±2.09和19.77±1.71mV(n=9,P<0.05)。由此可知,工频磁场作用可明显改变IA的激活特性,使激活曲线向左移动,并改变其斜率因子。
图5 对照组、工频磁场照射组IA的激活曲线
Fig. 5 Effects of magnetic field irradiating on steady-state activation kinetics of IA.
4. 结论
实验结果表明,2.0mT、50Hz工频磁场作用,使小鼠皮层神经细胞膜瞬时外向钾通道电流IA受到一定程度的抑制,且这种抑制作用呈现时间依赖性、电压依赖性。结果还表明,工频磁场的作用可使IA的激活曲线显著地左移,且改变曲线的斜率因子。说明工频磁场作用皮层神经元,引起神经细胞膜瞬时外向钾离子通道IA的激活过程受到抑制,使得动作电位复极化早期电压依赖性钾通道的开放延迟且关闭加快,从而使得K+外流减少。这一结果为各种家用电器对人体影响及磁疗产品对真实的治疗疗效提供实验参考。
电压门控离子通道是神经元电活动的分子基础,它参与初级生物信息传导,并在神经动作电位的产生、突触传递和其它重要的生理功能中起着重要作用。电压门控Na+ 通道决定了动作电位的产生,Ca2+ 通道是再生电位产生的基础,而K+ 通道在调节神经细胞膜兴奋性、神经可塑性及在神经元的信号调控过程中起主要作用,同时也是某些神经毒素和药物作用的靶点。通过抑制瞬时外向K+ 通道激活,使胞内钙浓度增加,对受损神经元起保护作用。瞬时外向钾电流IA是动作电位复极化早期外向电流的主要成分,主要调节静息膜电位,减慢去极化的速度,决定动作电位产生的频率。工频磁场作用改变小鼠皮层神经元瞬时外向钾通道电流的稳态激活特性,从而会影响神经元动作电位的形成和发放,最终调节神经元的生理功能。
磁场的生物刺激作用机制和作用靶点目前尚不明确,仅限于一些假说,而低频电磁场对有机体的作用更是一个非线性、瞬态的复杂过程。本实验从细胞膜电压门控钾离子通道角度研究工频磁场这种极低频磁场的生物刺激作用。磁场作为一种物理因素,对运动的带电物质有洛伦兹力的作用,影响细胞膜的离子通透性和膜两侧的电位,引起机体内环境平衡,从而影响带电物质的转移过程,产生一些生物效应。本实验结果提示工频磁场的生物刺激作用与细胞膜离子通道特性及通道构形变化有关,但仍需进一步从分子生物学及细胞信号转导方面进行分子层面的理论和实验验证。
 
 
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