补充：蔡注解5最后一句说：“韩文有数据说NgAgo不能切割线性DNA”，据此推断“NgAgo不能切割基因组，因为基因组DNA就是线性的”，这是没看懂韩的论文，而且反映了[..]分子生物学基础很差。韩的论文中的原文是：”NgAgo did not cleave linearized plasmid or ssDNA (Supplementary Fig. 3). These data

suggest that NgAgo is not an exonuclease.“， 意思是NgAgo 不能单独切割线性质粒DNA和ssDNA，也就是说必须有ssDNA和质粒DNA同时存在时才能切割，这说明NgAgo是内切酶而不是外切酶。

专家回复：需要学习的是你自己，既然发过几篇论文，怎么连个电泳图也看不懂？在图4e中，虽然NgAgo和Cas9的guider序列相同，但他们是不同的内切酶，切割位点不同。Cas9的切割位点在距离PAM序列四个碱基的位置，而NgAgo的切割位点是靶点内的序列，并且会随机抹掉一段靶点内的序列。

切割之后，在细胞内由内源核酸酶去除几个碱基，内源连接酶修复DNA双链切口，并造成突变型。

检测时，PCR扩增目标序列，由于野生型和突变型之间，NgAgo和Cas9切割位点处的差异，T7消化在再次从NgAgo和Cas9切割位点处切断。NgAgo和Cas9切割位点不同，产物长度自然不同。

NgAgo会随机抹掉一段靶点内的序列，所以产物较小。

verstehen?

图4a中，不同的guider DNA虽然位置有所不同，但被NgAgo的切割，并且随机抹掉一段靶点内的序列后，两端的长度在不同gDNA之间就都差不多了。