The story of DNA (II)

说起噬菌体，我不是很了解，只是从书本中见过，感觉很有趣而已。本科时接触过一位教授，科班出身，多年从事噬菌体先关的研究，其志在改写教科书，让我很是佩服，至今还留存从他手里购买的Hardcover教科书：噬菌体：在细菌致病机理及生物技术中的作用。正如其名，噬菌体是能吞噬细菌的一种生命体（有人认为它离不开宿主，不算是一种生命，更像是一种化学物质，不知现在对生命的定义是怎样了）。发现它的存在，是从细菌被神秘裂解的时候开始，这件事发生在一百年以前的英国。

早在烟草花叶病毒发现开始，人们认识到一种看不见、及其微小、可繁殖、可侵染的生物——病毒。上世纪初，英国细菌学家Frederick William Twort和他的哥哥，Dr. C. C. Twort，多年从事于病毒的分离工作，希望能分离到一种没有致病性的病毒，他们推测这可能会是致病性病毒的野生型。当时在制备天花疫苗的时候，经常会污染葡萄球菌（Staphylococcus），当时Twort猜测这种细菌可能是维持牛痘存活的必需物质。体外培养这株细菌时，他加入了一些天花病毒。他发现了几个较大的菌落，而且伴有不同颜色。可是在放大镜下观察时，他发现一个微小的区域，菌落开始变得透亮。直觉告诉他，这里的细菌被裂解了。但他并没有认为这是由于独立的生物体诱发的，而是推测可能是细菌分泌的一种酶将菌体裂解了。这些结果于1915年发在《The Lancet》（TwortF W. An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses [J]. Lancet,1915, 186(4814):1241–1243），文中模糊的描述了一种生物有传染性，可经过细孔径的滤膜、可破坏细菌结构。不过他的工作并未引起人们的重视。

另一位法国-加拿大籍的细菌学家 Felix d′Herelle于1917年也发现了类似物，且更为直接的描述噬菌体的分离方法：将细菌接种到营养培养基中，培养基开始变浑浊；感染噬菌体，发现细菌死亡，被裂解，产生子代噬菌体，培养基变为澄清；用陶瓷过滤器（porcelain filter）过滤菌液，除去细菌及大颗粒物质，只有直径较小的噬菌体可以通过。

1921年，大部分细菌学家认为裂解细菌的是细菌酶，而不是病毒引起的。此时HermannJ. Muller意识到这种生物不仅可以繁殖，而且可以突变。他预言到这种生物与基因很相似。

第一个电磁镜头是于1926年由Hans Busch发明的，首次组装的原型电子显微镜是由德国的物理学家ErnstRuska和电器科学工程师Max Knoll于1931年完成的，拥有放大400倍的观察能力，这也是首次在理论上阐述了电子显微镜的原理。

这确实给研究病毒的人们带来了福音，1939年新泽西，Camden的RCA制造了美国的第一批电子显微镜，它们第一时间被用来观察细菌；1941年Stanley看到了杆状的Plantviruses颗粒，Chanmbers等人观察到非常小、圆形的Influenzaviruses；次年Sharp等人拍摄到Papillomaviruses和Equine encephalomyelitis virus的颗粒图像；1942年Luria和Thomas F.Anderson利用电子显微镜首次看到了吸附细菌表面的噬菌体；次年，Delbruck也加入到电子显微镜观察噬菌体这个过程，观察了四株噬菌体侵染大肠杆菌、吸附。结果甚至有些让人惊讶：噬菌体竟然像蝌蚪，呈精子状，而且是有尾巴的颗粒。

1949年Anderson发现T4噬菌体在水中会失活，后续发表了他的电子照片，显示了被渗透压冲击失活的噬菌体中释放的DNA，其指向沿着同一条直线（确实很奇怪，不知噬菌体结果的时候会怎样解释呢？）。1951年，Roger Herriott给Hershey的信中写道：病毒也许像一个装满遗传物质的皮下注射器那样不用进入细胞，只需用酶把细菌的壁挖个小孔，即可把病毒的遗传物质注入细菌。（时间证明这是大胆而正确的猜测）

1928年圣诞节在费城召开的美国物理学会议上，Max Delbrtick与Salvador E．Luria相遇（不亚于我们的毛、朱的会师）。之后的数十年，二人的合作给生物界带来了太多的新奇和发展。上世纪三十年代那阵儿，人们认为病毒是化学物质，不是生物。（后来，人们不再认为噬菌体是“分子”（Molecule），而是一种结构复杂的生物体。）

Luria等人为了进一步了解这“看不见”的病毒，他们借用了X-ray技术。S. E. Luria and F. M. Exner, The size of streptococcusbacteriophages as determined by x-ray inactivation, PNAS, 1941, 27:30。前期的工作者通过过滤和离心的方法收集到噬菌体颗粒，并初步确定了噬菌体颗粒直径在8-20 mμ (Phage S13) ~ 50-75 mμ (Phage C16). Streptococcus Phage K的直径约为50-70mμ，近期有研究者应用放射性实验来计算噬菌体颗粒直径。对于一种特异的噬菌体而言该实验室可高度重复的，经过一定强度的X-Ray辐射后，计算噬菌体的存活率，这就是“靶学说”（Hit Theory），表明了噬菌体颗粒是经过单一离子辐射（或激发）而失活的，也间接的通过照射后存活的噬菌体数量来计算噬菌体颗粒的直径。

1942年 Delbruck和Luria建立了检测噬菌体生长的方法——噬菌斑实验，并初步发现噬菌体的生长曲线，一样包括潜伏期（latent period）、生长期（rise period），最后是裂解释放（burst size）。同年，Delbruck和Luria发现失活的噬菌体依旧可以吸附在细菌的表面，并且干扰着细胞生长的活力及其被噬菌体侵染的能力（当时人们认为放射性应该是使得病毒发生突变）。

通常来说，噬菌体侵染的最后阶段会裂解细菌，使得培养基重新变的透明。可如果继续培养（更长）一段时间，培养基又会重新变的浑浊，这说明有一些细菌拥有了抵抗噬菌体侵染的能力，并且这种抗性得以遗传下去。该现象已被发现已久，人们比较了前后细菌的生长能力、形态、代谢特征、血清型以及菌落型（可惜，当时没有基因型），但一直没有阐明其详细的机制或更能让人完全接受的解释。有两种假设：有一部分人认为这种突变时由于噬菌体的感染，在自然选择的条件下细菌发生了“进化”，获得抗性的细菌得意存活下来（获得性突变），坚持这种说法的包括Felix d′Herelle；而Gratia和Burnet等人认为这种突变是在细菌培养的过程中，在接触病毒前自然发生的（突变假设），只是发生突变的比率比较低。

Luria S E, DelbrückM. Mutations of Bacteria from Virus Sensitivity to Virus Resistance.[J].Genetics, 1943, 28(6):491-511.

这篇描述“波动实验”的文章，标志着细菌遗传学的诞生。（看到这篇我已不忍停下，有种必须看完的感觉）Luria和Delbruck的实验设计的很巧，并且有自己的数学推论作为依据。其实这两种假设中有可以区分的地方：若是突变假设，则接触噬菌体前的任何时间细菌均可能发生突变，在平板上的会长有不同数目的菌落，波动较大；若是获得性突变，在菌落的数会是随机分布，波动较小。是的，他们的结果证实了他们的突变猜想：抗噬菌体细菌的突变是自发产生的，与噬菌体的侵染无关（现在看来这是不准确的）。记得当时的研究仅仅能观察到细菌表面不易于或不能再结合噬菌体从而获得抗性，人们并不知道细菌内部也会发生变化。

Luria S E. AGrowth-Delaying Effect of Ultraviolet Radiation on Bacterial Viruses. [J].Proceedings of the National Academy of Science, 1944, 30(12):393-397.

本文选用三株噬菌体，经过不同剂量的放射性照射，并检测了噬菌体的存活能力、潜伏期长度、释放的病毒颗粒数目（1930s有报告显示UV和X-ray的照射能够使噬菌体失去了侵染性）。Luria又一次看到X-ray的照射能够使噬菌体失活，观测到了被延长的潜伏期。但是，最终释放的病毒颗粒在各组间却没有明显差异，他推测这种照射延迟了噬菌体的生长速度。

上世纪四十年代关于噬菌体研究的实验方法、条件、参数、检测的指标很杂，全世界估计只有十余家实验室从事噬菌体相关研究，但每个团队都有自己系统的研究方法。便于大家更好、更便捷的交流，Delbruck建议大家集中关注七株具有代表性、研究相对详细的噬菌体。于是，1944年，多数人们默认了《噬菌体条约》，只围绕研究T组噬菌体（Type I~VII）和大肠杆菌B菌株间的关系。该方法确实给研究带了飞快的发展，其中不乏一些T组之外的人士也取得了可观的成果。

1949年生物化学家Cohen利用同位素标记的方法发现噬菌体（几乎）全部由蛋白质和DNA组成（解开了我的一个疑虑），这种技术加快了在微生物中区分蛋白质和DNA的步伐。不过也有方向出错的时候，卢里亚曾一度提出：蛋白质也许是噬菌体的遗传物质。（是当时一些复杂的噬菌体重组实验给人一种假象，在处理或分离噬菌体组份的技术也不够完善）

不过，人们孜孜不倦的追求，渐渐的揭开了真理的面纱。

Hershey A D, ChaseM. Independent functions of protein and nucleic acid in growth of bacteriophage[J]. Journal of General Physiology, 1952, 36(1):39-56.

这篇报道来自冷泉港实验室，来自Delbrtick，Luria，Hershey和Cohen带领的非常优秀的团队。在此之前，人们对噬菌体的生活周期知之甚少，仅仅知道在吸附细菌后，它们的感染性消失了。约十分钟的时间，产生了许多有感染性的病毒颗粒，直到最后将宿主全部裂解，释放子代噬菌体。本文通过不同放射性同位素分别标记噬菌体的蛋白和DNA，Hershey和 Chase设计的非常完美的实验显示：噬菌体在感染时，蛋白质组分留在了细菌的外部，只有DNA进入到细菌体内。他们以一种确定性的方式最终证明-——遗传物质是且仅是DNA。

能走到这一步，确实需要很多铺垫：比如对噬菌体生活周期的详细分析、对噬菌体突变体的研究、对同位素标记的控制；比如发现T2噬菌体在感染早期需要将蛋白外衣内部的DNA注射到细菌体内，而外部的蛋白壳便完成了使命，不再具备任何功能；比如在高浓度NaCl溶液中噬菌体会失去侵染的活性，Anderson的电镜清晰的显示此时的噬菌体是一个空壳的“幽灵”，Herriott 发现突然改变渗透压会是的噬菌体释放头部的DNA；比如人们发现蛋白会结合在细菌的表面，人们已经可以用抗体血清检测到噬菌体蛋白的存在（但对DNA的存在还是没有办法跟踪）；再比如噬菌体的蛋白外衣可以阻止DNase对噬菌体DNA的影响等等。

简单回忆一下这个实验的精华部分：

在含有P³²（标记DNA）或S³⁵（标记蛋白质）加入到细菌的培养基中培养细菌，~4h后感染噬菌体，过夜培养，次日经过三轮低速（2,000 x g）和高速（12,000 x g）离心搜集到的就是标记好的噬菌体（<4μC/ml）。

S³⁵标记的噬菌体感染细菌，发现细菌外部的蛋白组份有放射性，产生的子代噬菌体没有放射性——蛋白没有进入细菌内部。

P³²标记的噬菌体感染细菌，发现细菌外部的蛋白组份没有放射性，产生的子代噬菌体有放射性——核酸进入细菌内部，作为遗传物质，指导产生子代噬菌体。

这样看确实显的实验很简单（以前学的或许比这还要简单），Hershey等选用噬菌体的三种突变体，观察了培养基、缓冲液、DNase、变性试剂等对噬菌体侵染的影响，通过不同的离心方法收集噬菌体感染前后的组份，确认放射性的子代噬菌体等等过程都是相当繁琐的。还要考虑是否有一些含有S或P的其他组份进入了细菌，是否会同样进入子代噬菌体而干扰实验结果的分析？不过，他们做到了。他们在生理水平上分离了可遗传的和不可遗传的组份，

这是阐明DNA的结构的里程碑式的发现，一扫多年来“蛋白质是遗传物质”的观点。从此以后，DNA真正走上了“国际”舞台。1969年，Max Delbrtick，Salvador E．Luria和Alfred D．Hershey共享了Nobel生理学或医学奖（比Francis Crick, James Waston和Maurice  Wilkins发现DNA结构晚了七年）。

后记

噬菌体吞噬细菌的过程很有意思：它们的尾巴在悄悄吸附到细菌表面的时候，蛋白外壳便停在那里开始“迷惑”细菌，通过尾部悄无声息的将头部的DNA注射入细菌内部。“光杆司令”进入到细菌的大本营后便开始指引周边的“士兵”为他组装子代。就这样，一批“大军”在积累，不到最后一刻，它们都安静的待在细菌内部。直到那一刻到来时，它们以迅雷不及掩耳之势裂解细菌，成万上亿的子代噬菌体冲出细菌，开始寻早新的宿主。浑浊般的细菌在几小时甚至更短的时间内就会被这样微小的病毒颗粒全部瓦解，是不是很可怕？

现在对噬菌体上个世纪中期的发现有一些了解，对目前的研究依然毫不知情。回想当时三十年的变化，稍稍能够感受到当时人们的专注、对真理的追求、把科研当作梦想的感觉。试想，如果你发现了这么一种神秘的噬菌体，会不会放弃？如果十年内没有发现什么呢？

从1938年到1960年，除了基因外，人们对什么也没有兴趣。当时从事生物研究的带头人多数是从非生物的领域“跳槽”过来的（物理学家、物理化学、化学家等）。从对化学家而言，转化因子是蛋白质还是DNA都无所谓，是DNA又怎样？所以有一些现象、发现被忽略也就不足为奇了。Luria说噬菌体组没有抓住DNA作为遗传物质的关键，不是因为Avery不专业，或发明有些抽象，而是因为实验证据实在不足。

不过，我个人还是对这个故事中的一个现象非常的感兴趣：细菌被噬菌体裂解后，仍然有部分存活。它们是怎么活下来的？细菌是如何抵抗噬菌体侵染的？它们的获得性免疫都有哪些？因为，这些和我近期阅读的文献（CRISPR/Cas9）很有关。大肠杆菌的复制一次约为二十分钟，如此短暂的期间内细菌，需要靶向噬菌体并彻底清除这些细菌病毒，确实很神奇。

TJ, Pharmaron

2016年1月6日星期三