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FlowJo分析细胞增殖
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FlowJo分析细胞增殖
作者：蔡何青，FlowJo 技术专员
CFSE法检测细胞增殖的原理：
CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
演示数据：
Proliferation tutorial：实验中所用的荧光染料为eFluor® 670
FlowJo分析细胞增殖的步骤：
1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）
2. 打开增殖分析平台：
到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye，如下图所示：
左边为拟合结果图，
右边为各个统计数据，其中：
RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项
选项中各个参数的介绍：
#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。
随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。因此荧光染料所能检测到的代数是有限制的，比如eFluor的检测范围为6代。研究结果表明，增殖分析可检测到的最大的代数为8代。
Peak 0：原代细胞（generation 0）峰的位置，可以依据未刺激对照来确定。
Ratio：子代细胞荧光强度占其母代细胞的比率，理论情况下为0.5，实际情况下，一般低于0.5，因为细胞分裂的过程中一般会有一些损失。
CV：变异系数，代表各个峰的宽度，理论情况下，每一代的峰的宽度是相等的。
Background：背景荧光值
4. 拟合步骤：
在“Option”选项中更改限制条件，得到最佳的拟合结果
4.1 确定增殖峰的数目：
目测峰数目 + 1。本实验中，依据步骤1中的直方图，其中目测峰的数目为5，那么确定增殖峰的数目为6。在#Peaks中输入6之后，按回车键进行计算
4.2 确定Peak 0 的位置：
依据未刺激对照来确定。本实验中为unstim样本，在确定目标细胞群之后，打开增殖分析平台，#Peaks数目为1，按回车键计算之后得到的拟合结果如下图：
确定出Peak 0的位置为37600，在Sample 1的增殖分析平台中勾选“Fix Peak 0”选项，在其中输入37600，然后按回车键进行计算。
4.3 确定Ratio的大小：
勾选“Fixed Ratio”选项，在其中输入，依据RMS值的大小确定输入的数据是否可取，RMS值越小则拟合越好。Ratio的值应小于或等于0.5
如果在确定了峰的数目、Peak 0的位置、Ratio值的大小之后，仍不能得到理想的拟合结果，可以再按照下面的步骤调整CV的大小和Background的大小。本演示实验中，在确定了上述3个参数之后，能得到理想的拟合结果
4.4 确定CV的大小：
勾选“Fixed CV”，输入数值后按回车键进行计算。可以依据未刺激样本来确定CV值的大小。
4.5 确定Background：
勾选“Fixed Backgd”，输入数值后按回车键进行计算。
FlowJo增殖分析的结果解释
RMS：root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
#Peaks: 增殖峰的数目
Peak cv：CV值，代表峰的宽度
Peak ratio：子代细胞荧光强度占母代细胞的百分比
Undiv. Mean：未分裂峰的平均荧光强度，即Peak 0的位置
Div. Index：Division Index，简写为DI，即分裂指数。所有细胞的分裂次数除以增殖刺激前的细胞总数。
Prol. Index：Proliferation Index，简写为PI，即增殖指数。所有细胞的分裂次数除以发生过增殖的细胞的数目。
% Divided：发生过增殖的细胞的数目除以增殖刺激前的细胞总数
Background：背景荧光值
Generation 0：原代细胞的数目
Generation 1：第一代细胞的数目
参考文献中对FlowJo增殖分析数据结果的引用
在撰写文章的时候，一般可以采用下面2个参数：
% Divided：the percentage of divided cells
Div. Index：average number of cell divisions
下面例子中：图中左上角为% Divided，左下为Div. Index
图片来自于：
Jason J. Coughlin. 2005. RasGRP1 and RasGRP3 Regulate B Cell Proliferation by Facilitating B Cell Receptor-Ras Signaling. The Journal of Immunology
https://blog.sciencenet.cn/blog-349948-604408.html
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