第六种耳聋基因检测方法有望应用于临床

我国每年有近3万新生儿先天性耳聋，其中60%是遗传造成的。目前临床上常用的耳声发射检测新生儿听力，有很大的局限性，假阳性率高，一般需要至少检测3次，给患者父母造成极大的精神和心理负担。

而耳聋基因检测就成为一种有效的补充检测手段，可作为部分病例常规测听或影像技术的辅助和补充检测技术，并实现远程检测；可以早于症状以及常规测听技术或影像技术发现耳聋易感人群，也可以用于婚前、产前耳聋基因检测，真正做到了早发现、早干预。相比较物理听力检查和拍X线片、CT、MRI等影像学检查，耳聋基因检测有更强的针对性和特异性，且取材方便，适用范围广。

遗传性耳聋具有很高的异质性，与耳聋相关的基因至少138个，已确定的基因至少44个。流行病学资料显示，在中国人群中常见的耳聋基因突变主要有3个，分别是GJB2基因、PDS基因和线粒体12S rRNA基因，也是目前耳聋基因检测的主要目标基因。

GJB2基因（位于13q11-12，编码间隙连接蛋白26，其分子量为26KDa，因此得名）突变导致的耳聋为语前、双侧、对称性耳聋，听力损失程度变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋，GJB2基因和先天性聋有着密切关系，中国先天性聋患者中携带有GJB2基因突变的约占20%。GJB2基因突变位点有很多，在中国人群中最常见的为235delC。间隙连接蛋白（connexin），是整合膜蛋白，6分子蛋白形成一个连接子，中间有2-3mm亲水性孔道，允许钾离子、钙离子和小的信号分子通过。在声音传导的过程中，进入毛细胞的钾离子会通过间隙链接重新回到耳蜗血管纹；如果间隙连接蛋白突变，离子交换受到影响，毛细胞的离子梯度失衡，从而引起听力损失，干预措施有配戴助听器和电子耳蜗移植，进行早期听力恢复。

2.1直接测序

 直接测序（direct sequencing，DS）是将聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物纯化、变性后，在测序仪上进行测序，为寻找突变的金标准。但其仪器设备昂贵，且操作复杂、耗时较长。此外，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。

2.2限制酶切指纹-单链构象多态性分析（restriction endonuclease fingerprinting-single strand conformation polymorphism，REF-SSCP）

限制性核酸内切酶切割目标基因的PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测梅切产物，根据异常构象带进行目标基因有无突变的判断。该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变，由各实验室报道的突变检出率冲99%到35%不等。同时该方法要求多次摸索条件，如电泳温度，胶中甘油浓度以及胶联度等均可影响检测的灵敏度。此外，该方法也不能确定突变的精确位置。

 2.3 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）

 是用特定的限制性内切酶水解目标基因的PCR扩增产物，然后分析酶解产物的电泳图谱特征，根据与正常对照的比对结果来判断待检样品是否存在某个基因突变，其弱点操作繁琐，检出率低，因为并非所有的基因突变都恰好位于某个内切酶的识别区[16]。

2.4 变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC）

 此技术是一项在单链构象多态性分析和变性梯度凝胶电泳基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术。它能对大批量PCR扩增产物进行筛查，其在检测大量致病基因的不同序列方面显示出高度的敏感性，适合做快速的基因筛查。但它也有一些不尽如人意之处：（1）它只是提供了定性的信息，而无法得出具体的突变类型和突变位点。尚需测序等后续方法证实；（2）其结果判断通常是由操作者进行的，容易产生观察差异，不利于各实验室之间的灵敏度比较；（3）许多片段有多个主要解链温度，需要筛查的温度较多，增加的工作量。目前该技术主要用来检测200~300bp大小的DNA片段，长的DNA片段的检测尚未见报道。

2.5基因芯片

基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术因其具有微型化、集约化和标准化的特点，在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势，可将对应于突变热点的寡核苷酸探针合成点或点加于DNA芯片上，通过一次杂交完成对待测样品多种突变可能性的筛查，实现对疾病的高效快速诊断。

 基因检测芯片技术具有高效率、高通量等特点，由博奥生物和301医院联合推出的耳聋检测基因芯片已经在国内率先取得国家食品药品监督管理局医疗器械证书，将有助于改变我国许多地区遗传性耳聋缺乏早期诊断的状况。可以提供从孕前、产前到出生的基因检测，帮助生育父母及时获知新生命的遗传信息并采取措施，降低新生儿患遗传性耳聋的概率。

3．第六种耳聋基因检测方法——飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）

质谱方法检测基因是首先进行PCR扩增目的片断区域，然后加入多对特异性引物，进行单碱基延伸，再将单碱基延伸产物纯化后打质谱，根据不同引物扩增产物的质荷比不同，判断有无碱基突变。

深圳华大基因临床检验中心利用质谱平台进行耳聋基因检测，快速准确的检测中国耳聋人群常见的3个基因突变热点，也可以根据需要加测其他位点。与基因芯片方法比较，价格更低，在新生儿听力筛查中应用前景广阔，可以及早发现听障儿童，及早诊断、干预。此外，该技术还可用于耳聋病人的病因诊断，为有耳聋患者或亲属的家庭提供生育指导，也适用于正常听力人群的婚前、孕前、产前筛查等。

综上，随着基因组学和分子诊断技术的发展，耳聋基因检测技术的优势也突显出来，高通量，高灵敏度和特异性，成本也越来越低，有望大规模应用于听力筛查或临床检测。