狂犬病毒糖蛋白抗体的检测与定量:现状与展望（6）

抗原结合检测的设计、优化和验证（i)

正如我们在前面已提到的，控制狂犬病和减轻其影响的最有效策略是疫苗接种运动。因此，用血清学检测进行计量以获得准确一致的结果极为重要。在这种情况下，尽管ELISA有时不能准确估计感染或接种疫苗后潜在的获得性免疫，因为该方法是同时测量功能性和非功能性抗体，但另有一些研究结果已经证明该检测方法与金标准检测具有良好的相关性。

此外，我们不能否认这种技术的所有固有特性，这些特性与金标准检测相比更有优势：更安全、(通常)不需要处置活病毒、通用性、高通量、高度一致的结果、消耗更少的时间和相关成本。最后，需要考虑的另一点是，ELISA是一种灵活的技术，很容易适应低水平配置的实验室，这使得它在狂犬病流行的发展中国家成为一种特别有用的候选技术。

因此，我们将简要讨论在开发、优化和验证 ELISA试验过程中需要考虑的主要问题。在设计一种检测方法时，应该牢记该检测方法的目的，也就是说，分析试验的目标和范围将指导最佳ELISA平台的选择。简单地说，ELISA检测样式取决于待检测材料的质量和类型： (i)纯度，抗原类型;捕捉类型(如有需要)及检测抗体(多克隆或单克隆抗体、抗原位点、同型抗原);(ii)检测系统，这也会影响该技术的灵敏度（sensitivity）、LOD（最低浓度样品检测极限）和LOQ（低浓度样品定量检测极限）。

一般来说，荧光技术比比色法灵敏度更高，需要的测试样品更少。此外，测试样品的特性(类型、来源、质量、可获得性)将决定样品处理的条件:例如，适当的稀释以保证其检测，避免基质效应（matrix effect），权衡是否需要执行血清热灭活方案，避免成正比的系统误差。

一旦选择了ELISA样式，确定检测的关键步骤就特别重要，可以通过对各个步骤的筛选来确定。在整个实验设计(DoE)中，对许多因素进行研究，以确定那些对检测的反应有显著影响的因素。在这里，专业知识和经验，以及来自文献的数据，将有助于这项任务的圆满完成。

 包被抗原的鉴定可能是ELISA试验最关键的步骤之一,同样重要的是捕获/ 检测的抗体的数量和类型。例如,使用狂犬病毒G蛋白作为包被抗原，在评估口服疫苗接种效果方面比用全病毒作抗原要好，因为VNA（病毒中和抗体）主要是直接针对糖蛋白的。因此，以糖蛋白作为包被抗原效果更好。此外，包被抗原的纯度也会影响检测的特异性。研究表明，纯化的抗原具有更高的均一性，干扰物质较少，对VNAs的评估效果更好。然而，也有报道称，抗原纯化方案可能会影响狂犬病毒G蛋白的免疫原性。

一旦确定了关键因素，就必须使用多元方法执行优化步骤，因为OVAT(一次一个变量)执行的优化过程根本不能保证达到真正的最优。相反，在多变量研究策略中，显著因素(处于不同水平)在预定义的大量实验中是同时进行研究的。

在之前的工作中，我们遵循了一个优化的多变量策略，使我们能够确认选用纯化的RV-VLP（狂犬病毒样颗粒）和狂犬病糖蛋白单克隆抗体(mAb AB5)作为该检测的关键成分。在RV-VLP中，狂犬病毒G蛋白以三聚体形式高密度存在于病毒样颗粒表面。

选择的检测系统(链霉亲和素过氧化物酶)也影响检测灵敏度，因此应选择作为额外的变量进行优化。此外，已证明单克隆抗体mAb AB5在处于其天然状态结构时能识别狂犬病毒G蛋白，这使其成为本试验的最可宝贵的特征，因为它可以识别病毒中和的必要表位。

（未完待续）

参考文献:

Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4 

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