狂犬病毒糖蛋白抗体的检测与定量:现状与展望（5）

抗原结合检测（Antigen binding assays）（ii)

竞争性酶联免疫吸附法(cELISA)检测

竞争酶联免疫吸附法(cELISA)是将Ag（抗原）固定在细胞培养板的固相表面，样品中的Ab（抗体）与酶标Ab竞争与Ag的结合。因此，在本实验中，信号数值越高，测试样品中Ab的浓度越低。Korimbocus等人描述的用于马抗狂犬病血清效力测试的另一种形式，是使用Mab（单克隆抗体） D1克隆，该克隆识别狂犬病毒糖蛋白的免疫显性表位之一，参与VNA（病毒中和试验）的诱导(位点III) ，证明与MNT（小鼠中和试验）具有良好的相关性。

他们还评估了人类抗狂犬病Igs，用PLATELIA狂犬病II代检测试剂盒和RFFIT相比，获得了更高和更多样化的滴度。

阻断性ELISA (bELISA)检测

阻断性（Blocking）ELISA (bELISA)是另一种形式的ELISA试验，Ag也固定在板孔的表面,但存在于测试样本中的抗体会阻断下一步的反应,也就是在测试样本中额外添加了一种酶标记的可结合Ag的Ab(图4)。因此,类似于cELISA,检测到的信号数值越高,表明在测试样品中Ab数量越少。一个商业化的bELISA例子是BioPro生产的狂犬病ELISA Ab试剂盒(o.k.servis BioPro的产品)，它采用粗制糖蛋白作为包被抗原，链霉亲和素-生物素作为检测系统。

图4  阻断性ELISA （bELISA）实验示意图。

1. 首先，抗原被固定在96孔板中。

2. 随后，血清样本中存在的抗体识别目标抗原的某个表位。

3. 生物素偶联抗体与未被检测样本中的抗体阻断的抗原相互作用。

4. 链霉亲和素-过氧化物酶偶联物与偶联Ab中的生物素相互作用。

5. 过氧化物酶与底物反应产生可检测的信号。

        检测到的信号数值越高，表明检测的血清样品中Ab的数量越少。

Wasniewski和Cliquet比较了BioPro和PLATELIA狂犬病II代试剂盒(ad usum veterinarium的兽用产品)的表现，确定前者在家养食肉动物血清样本中表现出更好的敏感性和与FAVN试验良好的相关性。进一步的研究表明，口服疫苗的狐狸和浣熊血清样本与FAVN具有良好的相关性。此外，BioPro ELISA还在一项国际合作研究中得到了进一步验证，该研究涉及欧洲不同疫苗株接种的狐狸和浣熊的血清样本。Dascalu等人也证明口服接种野猪和狐狸的FAVN试验具有良好的相关性。

最近,Fontana 等人发布了一个验证bELISA定量检测多宿主物种狂犬病血清免疫球蛋白的结果，采用了纯化狂犬病毒样颗粒(RV-VLPs)作为抗原，生物素偶联的单克隆Abs作为检测系统(图4)。结果证明，用PLATELIA狂犬病2代试剂盒进行的bELISA检测和MNT（小鼠中和试验）检测的结果具有良好的相关性。尽管必须进行进一步的鉴定，评估更多的血清样本，并且必须保证试验的重现性，但该试验已显示出是PEP（狂犬病暴露后预防）方案和狂犬病监测项目中金标准方法的潜在替代方法。

还开发了其他似乎是有希望的替代方法，与RFFIT显示出良好的相关性。例如，将电化学发光(ECL)方法应用于bELISA，即使用ECL标签和碳电极板（carbon electrode plates）来检测抗原与抗体的结合，其结果与传统的ELISA检测方法相比具有更高的灵敏度并能更快出结果。此外，间接荧光抗体试验也是一种狂犬病免疫球蛋白检测的半定量试验，通过荧光信号来评估狂犬病Igs的存在，只需1.5小时即可获得结果。然而，荧光显微镜当然是必需的。此外，基于免疫层析原理的RAPINA(快速中和抗体)试验被提出作为一种快速检测人血清样品中是否存在中和抗体的替代方法。后者可能是一种有用的替代技术，可用作现场调查工作的初始筛查方法。

（未完待续）

参考文献:

Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4