狂犬病毒中和抗体的检测与定量：现状与展望（3）

狂犬病毒中和抗体测量的替代方法:

伪型( pseudotyped）病毒中和检测

在过去的几十年里，由携带异源糖蛋白的重组病毒载体构建的伪型病毒已被广泛用于建立安全和通用的血清学试验。利用这些载体在体外或体内检测VNA(狂犬病毒中和抗体)，可以更安全地评估多种毒株或基因型的病毒。重组载体通常通过瞬时转染的方法产生，获得的病毒颗粒不具有复制性，因此可降低实验设施所需的生物安全等级。

慢病毒（Lentiviruses）是用于这一目的最常见的重组载体，被用于多种包膜病毒，如埃博拉、中东呼吸综合征、丙型肝炎、流感病毒，以及最近的SARS-CoV-2（新冠病毒）。包膜蛋白、内核（core ）和包含报告基因的基因组是伪型病毒系统的基本构件。在伪型病毒系统中使用了几种报告基因，由于荧光蛋白(更常用的是GFP)和荧光素酶( luciferase)具有更高的灵敏度和通用性，可以进行高通量筛选，因此是最常用的报告基因。 前者用荧光显微镜或流式细胞仪测量信号，后者用光度计测量信号，在获得信号之前必须先进行细胞裂解步骤(图3)。为了保证各种检测方法的结果具有可比性，滴度应统一按中位组织培养感染剂量(TCID50)进行报告。此外，重要的是确认生产细胞系(通常是HEK293T)、转染方法(化学或物理的）、培养条件和收获时间的最优方案，以标准化LV（慢病毒）生产方案，确保LV滴度检测结果一致，从而获得一致、准确和可重复的结果。

对于狂犬病，这些重组病毒以G蛋白作为包膜蛋白构建伪型病毒(图3)。Wright等人描述了FAVN（荧光抗体病毒中和试验）和伪型病毒检测之间的高度相关性，获得了100%的特异性和94.4%的敏感性。后来，Nie等人开发了一个高效的狂犬病假型慢病毒生产平台和一个强化的体外和体内中和试验，用于评估狂犬病疫苗。他们将这些方法与目前的RFFIT（快速荧光灶抑制试验）进行了比较，发现两种方法之间存在良好的线性相关性(R2 =0.946， <0.001)，而且伪型病毒检测显示了更好的重现性。

图3.  使用GFP（绿色荧光蛋白）作为报告基因的伪型慢病毒检测示意图。

1. 首先，将慢病毒结构质粒和含有报告基因的转移载体共转染包装细胞。用RABV糖蛋白表达质粒对重组病毒进行伪型慢病毒分型。

2. 转染48小时后，收集含有慢病毒的培养上清并滴定。

3. 随后，将已知数量的慢病毒颗粒与稀释的血清样品进行预孵育。

4. 将混合物加入到目标细胞培养中并孵育48 小时。

5. 最后，用流式细胞仪测量GFP信号。

（未完待续）

参考文献:

Rodriguez MC, et al., Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Sep;105(18):6547-6557. DOI: 10.1007/s00253-021-11515-4