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[转载]EMBO J | 梁海华团队解析致病菌生物被膜的调节机制

已有 272 次阅读 2020-4-2 10:51 |个人分类:热点研究|系统分类:论文交流|关键词:学者|文章来源:转载

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种人类条件致病菌,具有急性感染(acute infection)和慢性感染(chronic infection)两种状态。急性感染状态下该菌具有高毒力,高运动性等特征,可在宿主体内扩散并造成严重的组织损伤;而慢性感染状态时细菌的毒性和运动能力降低,在宿主体内进行固着生长,形成由自身产生的胞外多糖包裹的有结构的细菌群体,即生物被膜(Biofilm),赋予菌体更强的抗药性和抗免疫杀伤能力(Jenal, Reinders et al., 2017)。慢性感染一旦确立,则会对临床治疗造成极大困难,感染极难治愈。因此,揭示铜绿假单胞菌的急-慢性感染转换机制,阻止慢性感染的发生具有重要的理论和临床意义。环二鸟苷酸(Cyclic-di-GMP)是细菌中广泛存在的一种信号分子,与细菌的生物被膜形成,以及急-慢性感染之间的转换密切相关。铜绿假单胞菌中存在着复杂的c-di-GMP调控系统,其基因组编码17个具有DGC结构域的c-di-GMP合成酶,5个含有PDE结构域的c-di-GMP水解酶,以及16个同时包含上述两个结构域的蛋白(Kulasakara, Lee et al., 2006)。因此,对于铜绿假单胞菌c-di-GMP合成酶的调控及激活机制进行研究,具有重要的理论和应用价值。


有研究表明,铜绿假单胞菌遭受到环境压力,如表面活性剂十二烷基磺酸钠(SDS)刺激后,细菌细胞会形成肉眼可见的聚集状态以抵御SDS的压力。而细菌细胞的聚集现象依赖于siaABCD操纵子中siaA和siaD基因的表达(Klebensberger, Birkenmaier et al., 2009)。基因siaD编码一种c-di-GMP合成酶SiaD,而siaA所编码的蛋白SiaA预测为一种具有跨膜结构的磷酸酶。然而该操纵子中的另外两个基因siaB和siaC的具体功能及其与SiaD的关系尚不清楚。

2020年2月24日,西北大学生命科学学院西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室梁海华教授团队Wiley合作学协会期刊EMBO J上发文:The SiaA/B/C/D signaling network regulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa,研究揭示了铜绿假单胞菌生物被膜形成的信号通路,及其调控过程。

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本研究对siaABCD操纵子的具体功能及这四个基因之间的关系进行了深入的研究:发现siaABCD操纵子编码一个信号系统,通过调节SiaD合成酶的活性控制细菌中胞内c-di-GMP的水平,进而调控细菌生物被膜形成和聚集现象。遗传学表型研究表明SiaA/C/D正调控,而SiaB负调控细菌聚集以及生物被膜的形成。此外,SiaC蛋白在这一调控系统中处于中心位置,是该系统的关键“开关”。SiaA及SiaB位于SiaC上游,而SiaD位于SiaC下游。首先,单独的SiaD几乎不具有合成c-di-GMP的活性;而SiaC是合成酶SiaD的结合伴侣,通过直接结合,激活SiaD的酶活性。其次,SiaC与SiaB,SiaC与SiaA之间亦可直接结合。

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图1. SiaC激活SiaD酶活性。(A-D),生物被膜型研究表明SiaD依赖于SiaC发挥功能。细菌双杂交(E)、GSTpull down(E)以及SPR(E)分析表明SiaC与SiaD蛋白直接结合。(H)体外酶活实验表明SiaC通过与SiaD结合,激活SiaD合成酶活性。


团队进一步地对SiaA和SiaB蛋白的功能进行了研究。利用P32放射性标记分析以及蛋白质质谱分析,证明了SiaB是一种新的激酶,可特异地磷酸化SiaC蛋白的第68位苏氨酸,而磷酸酶SiaA可特异地去除该位点的磷酸基团。SiaC单独蛋白以及SiaC-SiaD-ADP复合物的三维晶体结构的解析,清楚地阐述了SiaB的催化机制。

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图2. SiaB-SiaC-ADP复合物晶体结构。(A)SiaC-SiaB-ADP复合物三给晶体结构;(B)SiaB-SiaC相互作用表面。


总结来说,如下图所示,细菌会影响胞外环境的变化,通过SiaA及SiaB调节SiaC蛋白的磷酸化状态:当SiaC被磷酸化,其不与SiaD结合,胞内c-di-GMP水平较低;而当SiaC处于非磷酸化状态时,其结合并激活SiaD,细菌大量合成c-di-GMP.因此SiaC蛋白的磷酸化状态对于其与SiaD蛋白质的相互作用至关重要,是直接控制SiaD合成酶活性的“开关”。综上所述,本研究揭示了与急-慢性感染相关的DGC合成酶酶活性调控的分子机制,为开发针对性的抗性菌药物提供了理论基础。

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图3. 铜绿假单胞菌SiaABCD信号系统调控生物被膜及细菌聚集分子机制。一般条件下(如丰富培养基),激酶SiaB发挥主要作用,催化SiaC磷酸化,阻止SiaC与SiaD结合进而激活其c-di-GMP合成酶活性。因此,低水平的胞内c-di-GMP不足以促进生物被膜及细菌聚集的形成。当细菌遭遇环境压力时(如SDS刺激),SiaA磷酸酶活性被激活,去磷酸化SiaC蛋白,促进SiaC-SiaD蛋白结合,激活SiaD合成酶活性。此时,高水平的胞内c-di-GMP激活生物被膜及细菌聚集形成。


点击链接了解文章更多信息:https://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embj.2019103412 



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