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Angew. Chem. | 上海交大张川、南方医科大冯景:模拟病毒的促融合泡对核外miRNA进行快速检测

已有 810 次阅读 2019-5-22 14:39 |个人分类:热点研究|系统分类:博客资讯

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核外的miRNA是临床诊断和疾病治疗监控过程中的重要生物标志物。然而,当前绝大多数检测核外miRNA的方法都牵涉到繁琐的步骤,耗费了大量资金的同时也占用了时间人力成本。


最近,上海交大张川研究员与南方医科大学冯景教授课题组密切合作向我们展示了一种利用模拟病毒行为的融合泡(Vir-FVs)在2小时内对核外miRNA完成快速、高效及高通量检测的方法。


在自然界中,有包膜的病毒通过自身与宿主细胞膜之间的融合,将核衣壳与蛋白质释放进入宿主细胞。受到这种机制的启发,本研究设计制造了一种模拟病毒的促融合泡对外泌体miRNA进行快速的原位检测(示意图1)。首先在细胞膜表面共同表达血球凝集素唾液酸苷酶蛋白(HN)与人副流感病毒的融合蛋白(F),模拟病毒包膜上的促融合蛋白。随后,分子标记物进入人工膜,含有分子探针的Vir-FVs对外泌体miRNA的原位检测通过三步进行。第一步是Vir-FVs上的HN蛋白与肿瘤外泌体表面过量表达的含有唾液酸的受体结合。第二步,F蛋白经历形态上的变化,插入外泌体膜形成VIr-FVs与外泌体的融合体。第三步,分子标记物识别目标miRNA并与之结合形成杂交双链,产生可以被流式细胞仪定量测定的显著荧光信号。


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示意图1 模拟病毒的融合泡(Vir-FVs)对外泌体miRNA进行快速检测的示意图

(A)Vir-FVs的制备

(B) HN蛋白与F蛋白介导Vir-FVs与外泌体miRNA的融合后,分子标记物与目标miRNA杂交


透射电子显微镜的图像表明Vir-FVs是单层膜的囊泡结构,平均直径180 nm(图1A)。共聚焦激光扫描显微镜图像和Western Blot的结果都证明了Vir-FVs的表面存在HN蛋白和F蛋白(图1B、C)。图1D证明了Vir-FVs 在PBS和血清中的稳定性,为Vir-FVs进入活体进行原位检测奠定了基础。


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图1 对Vir-FVs与外泌体的描绘

(A)表征Vir-FVs与外泌体的TEM图像(比例尺100 nm)

(B)CLSM图像显示HN蛋白与F蛋白存在于VIR-FVs的细胞膜表面(比例尺,5 μm)

(C)囊泡膜表面HN蛋白与F蛋白的Western Blot分析

(D)VIr-FVs在0.01 M PBS与50 %无外泌体血清中72小时后的直径变化


为了验证Vir-FVs的融合稳定性,分别用Dil和DiO标记Vir-FVs和外泌体。用CLSM成像来监控融合过程。图2A显示在孵化2小时后,Dil的荧光信号与DiO的信号共同出现,说明Vir-FVs与外泌体之间产生了膜融合。值得注意的是,当外泌体与Vir-FVs的比例在10:1到1:1之间变动时,融合效率始终保持了较高的程度。但是当外泌体的比例进一步提高时,融合效率急剧下降。图2B的TEM图像显示了融合过程,图2C表明Vir-FVs与外泌体融合2小时后,产物的直径从190nm上升到361.5nm,而没有HN蛋白与F蛋白的对照囊泡(Con-EVs)与外泌体融合后,直径没有变化。图2D表示了用标准去猝灭方法来研究HN和F蛋白介导的膜融合的动态过程。在用Dil(受体)和DiO(供体)进行双重标记的Vir-FVs中加入额外的脂质膜,融合过程使得染料之间距离增加,FRET效率降低。如图2E所示,将Vir-FVs与外泌体混合,由于膜融合导致供体和受体在一定的空间范围内的稀释,被Dil猝灭 的DiO的荧光信号逐渐恢复,在80分钟后达到平台期,说明融合的过程非常迅速。而如果是将Con-EVs(缺少HN与F蛋白)与外泌体混合,由于缺乏膜融合的过程,荧光信号在2小时后仍然无法恢复。这说明了Vir-FVs与外泌体的融合确实是由HN蛋白与F蛋白介导的。

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图2由病毒蛋白介导的Vir-FVs与外泌体的融合

(A)Vir-Fvs与外泌体不同比例时的融合效率的CLSM图像,比例尺10 μm

(B)表征囊泡融合的TEM图像

(C)不同时间间隔后融合产物的直径变化

(D)囊泡融合过程中FRET分析检测的示意图

(E)Vir-FVs与外泌体融合的动力学分析(通过基于FRET稀释的供体释放恢复来测量融合)


当Vir-FVs与含有miR-21的肿瘤外泌体孵化后,由于融合作用,相对荧光强度明显提高,而Con-EVs与含有miR-21的肿瘤外泌体孵化后荧光强度保持在背景水平。而单独用分子标记物与肿瘤外泌体孵化也会发现轻微的荧光强度上升,这可能是由于外泌体的轻微损伤释放出了少量的miR-21。CLSM图像证明了图3A的结果。为了通过与肿瘤相关的miRNA来分辨肿瘤外泌体正常外泌体,团队进一步用人乳腺癌细胞(MCF-7)和人乳腺上皮细胞(MCF-10A,正常细胞)与Vir-FVs孵化,并用流式细胞仪进行分析。图3C说明,与正常外泌体相比,肿瘤外泌体与Vir-FVs孵化后,荧光强度高出很多,达到了7.4倍的差距(图3D),这可能是由于肿瘤外泌体中miR-21水平的提高。


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图3 用Vir-FVs来对miR-21进行原位检测

(A) 具膜结构的囊泡与肿瘤外泌体孵化2小时后的相对荧光强度

(B)CLSM图像显示分子标记物与外泌体miR-21进行了成功的融合(比例尺,5 μm)

(C)Vir-FVs与正常细胞外泌体/肿瘤外泌体孵化的流失细胞分析结果

(D)Vir-FVs与正常/肿瘤外泌体融合后的荧光强度


本研究进一步应用VIR FVS对乳腺癌患者和健康献血者血清中的肿瘤外体进行检测。图4A、B说明癌症病人(体内有肿瘤外泌体与正常外泌体)的血清与Vir-FVs孵化后,融合体的荧光强度分成了两组,一类荧光强度高的代表了肿瘤外泌体的存在,荧光强度低的代表了正常外泌体的存在,而正常人血清与Vir-FVs孵化的结果只有一组即正常外泌体。定量分析的结果(图4C和D)与图4A、B一致,表明通过对肿瘤外泌体中miR-21的识别,可以进行精确的诊断。


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图4 Vir-FVs可通过对肿瘤相关的miRNA的识别来分辨肿瘤外泌体与正常外泌体。

(A)癌症病人血清与Vir-FVs孵化后荧光强度的双变量点图

(B)正常人血清与Vir-FVs孵化后荧光强度的双变量点图

(C)Vir-FVs与癌症病人/正常人血清孵化后的流式细胞仪计数

(D)Vir-FVs与癌症病人/正常人血清孵化后融合囊泡的荧光强度


总的来说,本研究构建了模拟病毒的促融合泡,通过表面的HN蛋白与F蛋白与外泌体的融合,将人工合成的分子标记物输送到融合体中与肿瘤标记物miRNA结合导致荧光信号的变化,达到对肿瘤细胞的快速高效检测。与常规方法相比,具有以下创新点:(1)运用病毒的融合蛋白介导融合,显著提高了Vir-FVs与外泌体的融合效率;(2)融合过程直接且快速,省略了耗时的前处理程序,避免了对外泌体的破坏;(3)不需要将外泌体miRNA从外泌体中提取出来,避免了外泌体miRNA的降解与污染;(4)可以对肿瘤衍生的外泌体进行特定识别与分类,为下游基因组测序和癌症分类分析提供了便利。基于此,本方法为临床诊断与疾病预后评估中快速高效检测外泌体miRNA提供了新思路。


原文阅读

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ange.201901997 



Angewandte Chemie

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以下内容摘自Angewandte Chemie作者须知(Notice to Authors)原文:

 

Communications and Research Articles present the results of experimental or theoretical studies of general interest or great importance to the development of a specific area of research. A short cover letter justifying why the manuscript should appear in the journal should be submitted. A Communication should be no longer than 2,500 words (ca. 20,000 characters), including all references, footnotes, and Tables. Chemical formulae, Figures, and Schemes may also be added. Research Articles (length up to 5,600 words, ca. 40,000 characters) may contain an Experimental Section and/ or Computational Methods. However, the editorial office requests that only the most essential parts of your experimental procedures are included in the Experimental Section; the rest should be presented in the Supporting Information.



期刊介绍


Angewandte Chemie, a journal of the German Chemical Society, with its excellent Impact Factor of 12.102 (2017) is maintaining its leading position among the general chemistry journals. It appears weekly in a highly optimized, reader-friendly format; new articles appear online almost every day. Founded in 1887, it is today one of the prime chemistry journals in the world, with an Impact Factor higher than those of comparable journals.


投稿网址:

https://www.editorialmanager.com/anie/default.aspx 




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