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PCR小传 精选

已有 3152 次阅读 2020-5-29 13:09 |个人分类:科学与历史|系统分类:科普集锦| PCR

对于新冠肺炎疑似患者,要想检测从患者身上提取的组织里是否含有新型冠状病毒的核酸序列,我们需要借助于核酸测序技术。除了疾病诊断之外,核酸测序还有很多用途,比如亲子鉴定、犯罪嫌疑人的身份识别等。不过,从被检测者身上获取的组织中,经过提取以后留下来的核酸数量往往很少,不敷使用。人们想,要是能不必重复从被检测者身上获取核酸、只是在实验室里就能合成其核酸拷贝就好了!上个世纪的分子生物学家们早就想到了这个问题。

20世纪下半叶,随着脱氧核糖核酸DNA双螺旋结构的发现与遗传密码的破译,分子生物学的大厦逐渐建立起来,而DNA在生命科学研究中的作用日益凸显。如果想对DNA进行分析,单靠原始拷贝是不够的,量太少,一旦实验了就没有了,所以需要对DNA样本进行体外复制,高效、大量的复制想要研究的DNA成为制约DNA分析的瓶颈。美国生物化学家穆利斯创造性地发明了体外高效扩增DNAPCR技术,使得只用微量DNA获得大量拷贝成为可能。

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凯利·穆利斯(Kary Banks Mullis

(图片来源:https://www.latimes.com/obituaries/story/2019-08-13/kary-mullis-dna-nobel-prize

 

凯利·穆利斯(Kary Banks Mullis1944年出生于美国北卡罗来纳州的勒诺,在南卡罗来纳州度过了童年时光。学生时代的穆利斯就对科学非常感兴趣,1962年进入佐治亚州理工学院学习化学,毕业后转入加州大学伯克利分校攻读生物化学博士学位,随后在堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校从事博士后研究。1979年入职西特斯公司(Cetus),这是世界上最早的靠重组DNA技术起家的企业,是世界上最早的生物技术公司之一,正是在这家公司,穆利斯发明了PCR技术。1986~1988年,在Xytronyx公司短暂工作后,他从1987年开始成为加州PCR技术与核酸化学的非官方顾问,后来在加州奥克兰儿童医院工作,并担任多家公司的科学顾问。

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2 PCR原理示意图

(图片来源:https://toptipbio.com/polymerase-chain-reaction-pcr/

 

在穆利斯之前,科学家已经开始研究DNA的体外分离技术,并且已经发现了合成DNA所必需的DNA聚合酶。不过早期的实验效率比较低,而且错误率较高。当穆利斯进入西特斯公司之后,从事合成寡聚核苷酸的工作,他也对重复而低效的工作产生了厌倦,总想着如何提高效率。新想法的产生完全是偶然的。19834月一个周末的晚上,他驾车与同事去往乡间别墅,他突然想到如果DNA片段的复制是循环往复的不就可以了吗?只要提供DNA复制所需要的模板、原料、酶和引物,DNA的复制就可以是自动完成的。这就是PCR技术,全称是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)。这个想法看上去也很简单啊!后来他查阅资料,竟然发现没有人想到类似的想法,而他的同事也多少对此表示怀疑。经过几个月的思考和准备之后,穆利斯开始了实验,经过对DNA复制的模板、双螺旋解开后再次变成双螺旋(复性)的反应温度、DNA聚合酶的量等因素的多次调试,终于在1984年的11月获得了成功!他们的工作马不停蹄,第二年春天就公布了研究数据、申请了专利、发表了研究论文。

回头来看,穆利斯的发明虽然有偶然因素,但也是在相关理论与技术发展到一定阶段才能实现的。科学家已经发现了DNA合成所需要的聚合酶,了解了DNA解开螺旋(退火)、引物在链上延伸的热动力学过程,还有早期DNA体外复制实验的成功,等等。这些理论与技术为PCR技术的实现奠定了基础。

同时,我们还可以看到PCR技术也是需要发展和改进的。当时穆利斯使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段,这种酶不耐高温,且复制的时候错配率较高;1988年,科学家改用了T4 DNA聚合酶,准确率提高了,但是需要不断加酶;直到西特斯公司从一种水生嗜热菌中分离到Taq DNA聚合酶,才实现了DNA体外扩增的高效与高特异性,这就为PCR技术的广泛应用扫清了障碍。后来,PCR技术又被科学家不断改进,产生出各种变体的PCR技术。

最开始的PCR技术,是把DNA进行体外扩增。但是像今年的新冠病毒,就不能简单地应用这种PCR技术,因为这种病毒携带的核酸不是脱氧核糖核酸DNA,而是核糖核酸RNA。通常DNA有两条互补的链,构成DNA的四种碱基是ATGC;而新冠病毒的核酸是单链的RNA,构成RNA的四种碱基是AUGC,原料和最终产品都不一样,体外扩增的策略也要不一样了。针对核酸是RNA的生物,人类发明了RT-PCRReverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)技术,或者称为逆转录PCR。具体原理是,以病毒的RNA为模板,合成出与之配对的单链DNA,这条单链DNA被称为互补DNAcDNA,然后再采用通常的PCR技术,对这段互补DNA进行体外扩增。不仅对于新冠病毒核酸的体外扩增要应用RT-PCR技术,想要在体外扩增艾滋病病毒HIV等逆转录病毒的核酸,也要应用RT-PCR技术。

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3  RT- PCR原理示意图

(图片来源:https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.svg

 

PCR技术的发明具有重要意义,使得应用微量的DNA样品实现体外的大量高效扩增成为可能,从而在生物学、医学、法医学等领域获得广泛应用。而穆利斯也由于发明了PCR技术而获得1993年诺贝尔化学奖。



 注:本文2020-5-29首发于“京师生物圈”微信公众号. 




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