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心脏宝宝的传代(实验室记录之十八)

已有 2273 次阅读 2014-4-9 13:57 |系统分类:科研笔记

                                       心脏宝宝的传代(实验室记录之十八)
                                               2013-7-22 17:36
 
昨天是原代心脏宝宝们的最后一天,今天就要传代成为第二代宝宝们了!
今日大暑。
嗯,对,今日大暑,给大鼠的心脏宝宝传代。
由于时间关系(也因为前几批培养已经给心肌宝宝们拍照并摄像了),没有给心肌宝宝最后留念,在镜下,他们依然有条不紊的在那里跳着这个世界上最优雅的舞姿。
你看或不看,他们都在那里跳动;
你想或不想,跳动的节律从未消失过。
就是这样的固有的本性,我喜欢!
但是,今天是心肌宝宝的最后一天。
(PS:原代的心肌无法传代----年初有美国波士顿儿童研究所发表报道,在健康人群心脏模型,年轻人的心肌细胞是可再生的,是数量的增加而非传统意义的体积增大。当然早在2009年Bernhard Kühn博士团队开始研究的同期,我国的戴建武再生医学研究室就已经着手研究心梗后活体心脏心肌细胞的再生重建,他们在可行的理论构架基于胶原蛋白纤维与内皮生长因子结合干细胞增生调控设想,希望在不久的将来,能够看到有意义的进展)。
这里实际是为心脏成纤维细胞宝宝传代。传代的关键:快且柔。
快,是指操作的动作要快,操作熟练 ,才能在最短的时间完成传代步骤,减小被污染的几率。
柔,说的是手法 ,换液,冲洗,吹打,胰酶消化,酒精过火,都要轻柔。每个人手法都会不同(比如,学到今天,我和我的导师手法也依然不同)。但个人体会,养细胞的柔,是快中有柔,是集速度与稳度的平衡,更像是一种太极。吸液体的吸管拿稳了,才会在方寸的超净台的舞台上,不滴撒浪费一滴珍贵的液体,稳而快速有度的移动,才会最大的减小无菌操作的暴露时间,才能更精准的一次定位液体与细胞培养板的距离。每滴散一次液体,掉落一次瓶盖,都会继续引发更多的补救步骤,喷酒精,擦棉球,过火,甚至,引起不必要的无菌空间气体的大幅度的流动。相信,每一次操作的失误或不仔细,不仅仅是在浪费自己的时间,更是在损耗精心培养的细胞的生命。
今天这一次,也是第一次没有事先打操作流程的草稿。
草稿已经在我的肚子里。
为了最大限度优化时间,我在脑海里反复过了进入细胞室的每一步,包括需要移动的步子。
9:17入细胞室,摆出所有已经提前准备过的用品(烧杯需要过酸高压,棉球需要高压,PBS需要高压后再4C,胰酶需要提前一天从-20C复温至4C),开紫外。
9:37,关紫外,开排风和空调。同时洗手。
9:47,入细胞室。
开超净台,点酒精灯,分装10%培养基(因为后期几天的培养需要更多的培基支持,所以多分装了几只,花了大约20分钟的时间)。
稀释0.25%至0.1%浓度的胰蛋白酶。
从孵箱取出细胞瓶,镜下观察。(90%以上的细胞密度,干净而清晰的形态!好有成就感哦)
弃液。PBS冲洗3遍,加胰酶,涮掉,留根,过火,盖盖,轻摇(水平,左右晃动,不能把消化下的细胞甩出去)。消化了三瓶,逐一摇晃镜观,见大部分变圆浮起(浮起的细胞会随着没静止下来的液体表面做快速的移动,就会与没消化下来的细胞形成动与静的截然景象)。3~5mins后逐一加培基中和,吹打冲洗,再将剩余的空瓶加入pbs冲洗吹打,一并收集倒入一只细胞瓶。加入适量的培基,轻柔调匀,均匀加入到9只细胞瓶,最后,用培基调整到2~3ml。
镜下观察。
圆圆的细胞球,比消化时安静了许多。
回到孵箱,就可以让细胞安静的睡觉喽 。
到这,其实工作只进行了一半。
剩下的,看似无用,其实是很重要的:清理细胞室。用到的每一处,超净台,酒精灯 镊子,签字笔,显微镜,封口膜,手套盒,无菌包...都需要注意的检查,棉球擦净,无菌封闭,酒精擦地,紫外照射。
出细胞室,清洗试验所用的烧杯,EP管,15遍流水,3遍双蒸水,3遍去离子水,烤箱烤干,然后分别入酸,等待48小时后出酸,同样流程冲洗,烤干,高压后再烤干,就可以照紫外备用啦。
回想,十个月,大致就是这样如此,一遍一遍又一遍...
要说与原来有什么不同,也有一点,就是原来是工厂打工的感觉,现在,觉得是在发挥自己主人翁意识。
一直没变的是,对培养细胞的耐心,和对生命的挚爱,毫不夸张的说 。没有这两点,就不会一路坚持到今天。
相信,明天会更好。

 



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