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鱼类性别决定研究的新方法和思路
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鱼类性别决定研究的新方法和思路
雄性和雌雄的在形态上，生殖策略和行为上的性别分化是最普遍的生物学现象。性别决定与性别分化相互联系又有所区别；具双向潜力的未分化性腺经过程序性发生的一系列事件，发育成精巢或卵巢，并出现第二性征的过程称为性别分化。而性别决定则是确定性分化方向的方式.鱼类是性别决定方式最为多样的一个类群，他们有着从环境决定到遗传决定的不同模式，不但有雌雄异体，还存在雌雄同体，性逆转等特殊的生物学现象。所以说鱼类可以作为一个非常好的模式生物来研究性别决定和性别分化。
Figure 1生物性别决定机制和性别分化的多样性，其中尤其是鱼类的多样性突出；作为脊椎动物的最大类群，提供了非常丰富的遗传材料供各国科学家研究，如斑马鱼，青鳉，半滑舌鳎等；阐明性别决定和分化的基础知识，不仅是对于基础知识的贡献，在生产上通过控制性别的达到增产也具有重要应用意义。
对于性别决定，其根本是基因差异；遗传基因作为性别分化的基础，提供了两性分化的可能性，而性分化则是在各遗传基因和外部环境因子的相互作用下实现的.性别决定机制的进化与一个非常奇特的基因组过程有关，即性染色体的形成；在哺乳动物中，性别决定基因(Sex Determining Genes,SDG)高度集中,形成性染色体.Y染色体性别决定区(Sex-determiningRegionof the Y)是决定精巢发育的核心,直接诱导精巢的发生与形成;如无该区段,双向潜力的未分化性腺则发育成卵巢.性别一旦形成,一般不易逆转.而在鱼类中,由于进化上的原始性,情形并不如此简单.目前通过细胞学手段发鱼类中性染色体类型有，XX/XY,ZZZO,ZZZW等；除性染色体外,常染色体上的某些基因和一些外部环境因素亦参与性别决定;根据现有的报道,在各种外部环境因素中,温度,pH 值,盐度,光照,水质,食物丰度和种群内部因素等都可能影响鱼类性别及其分化,外源激素作为人工施加的环境因子亦能够影响鱼类的性别，形成性逆转。
研究鱼类的性别决定基因，最重要的一个工作莫过于确定鱼类的性染色序列，然后获得基因信息，根据基因的序列分析，表达模式，甲基化模式，结合反向遗传学手段，如基因敲除，突变体技术等，来准确确定一个性别决定基因。然而由于性染色体的的退化性和高重复序列含量。获得性染色体的组装结果往往非常困难；到目前为止，只有的人，大猩猩和猕猴；鱼类中也只是在青鳉中的Y染色体上测序了雄性特异区。这些分析提供了重要的见解Y染色体的演变，它们的基因组成及其退化过程；目前主流的学术观点认为，异型性染色体的退化是一个逐步，长时间的过程；而鱼类的性染色体形成的时间都比较短，所以，相比于高度退化，高达2亿岁的鸟类W染色体一直没有染色体序列，鱼类W染色体应更适合进行测序研究，ZW性染色体的形成及其性别决定的分子机制。
组学工具助力性别决定和分化研究这里从一个通过半滑舌鳎基因组测序1研究ZW性别染色体的例子。半滑舌鳎是ZW性别决定系统，但是确存在一个特殊的现象，就是性别逆转现象，ZW的鱼正常温度（22℃）性逆转比例大概只有14%，但是如果提高到28℃，性别逆转比例就高达73%。说明温度在调控性别分化的研究中有重要作用。
这个研究主要探究了以下问题：
ü 如何获得ZW的染色体序列；
ü 鱼类ZW的染色体的基本特征是什么？
ü 鱼类中的ZW染色体和鸟类中的ZW染色体的进化关系如何？是同源的吗？
ü 相关的性别决定基因可能是？机制是？
如何获得ZW染色体序列？1) 通过高通量测序分布测序了一只雄鱼（ZZ）和一只雌鱼（ZW）；然后分别进行组装。
2) 由于ZW染色体的序列差异比较大，组装的时候分别都组装出来了。但是如果将测序的序列比对回基因组，ZW的测序深度将会是常染色体的1/2.
3) 通过深度减半的特性，如果一个序列在雄性中存在（ZZ），但是在雌性中测序深度减半，那么它就可以归属为Z染色体上的；
4) 同样做减法，如果雌性（ZW）中深度减半的序列在雄性中（ZZ）中不存在，那么它就是ZW染色体上的。
5) 最后得到16.4 Mb属于W染色体，23.3 Mb属于Z染色体；
6) 根据雄性中微卫星marker将Z的scaffold连接成染色体。根据Z的染色体将W染色体连接成假染色体。
个人认为，由于组装zw的全部是用短序列（100-150bp）的reads，而性染色体序列是高重复的，所以W染色体上一些和Z同源性高的区域应该没有组装出来。现在第三代测序技术，reads 长度能够超过100kb。平均读长达到15kb左右，而且成本持续下降，如果现在做这项研究我认为完全可以测序80X左右的pacbio数据，利用最新的falcon-unzip2对于二倍体中的两套染色体分别组装，再根据hi-c或者bionano等物理图谱技术，可以分别组装出ZW染色体。
鱼类ZW的染色体的基本特征是什么？先看Figure 2 详细的画出了，ZW染色体上重复序列情况，基因之间的关系。从这个图上可以明显看出ZW染色体的异质性；常染色体上只有4.33%的重复序列，而Z，W染色体上却分别有13%和29%的重复序列。Z 上有个基因904，而W上只有317个基因，其中W染色体有19.74%的假基因，而Z染色体和常染色体只有3.54%和2.48%。而在人和大猩猩的Y染色体上只有40-80个基因，X染色体上的基因有1098个。生物学的一个基本思路就是比较，通过这个比较就可以发现，半滑舌鳎的性染色体确实是年轻，同时研究者利用序列的关系也准确计算了ZW的形成仅仅只有2000万年，而XY和鸟类的ZW系统的起源至少有数亿年。
研究团队将重点研究了ZW染色体的两个块，第一块是Figure 2中的橙色区域（~640 kb，22 genes + 1 pseudogene），命名为假常染色体区域（pseudoautosomal region：PAR），因为这个区域在ZW染色体上高度相似。这个区域没有性染色体常见的剂量补偿。第二块是ZW共有，它们的Ks为0.15 ，远大于0.0115的常染色体和0.0188的PAR区域。不止于此，作者还对Ks的分布曲线做了研究，发现是一个单峰，从另一方面证明这个区域是没有常染色体的混合片段，是导致性别分化的关键区域。
性染色体的异质性导致了雌性个体的基因组差异。同时也带了一定的问题，如和Z性连锁的基因在ZZ的基因组中的表达是2，那在ZW中却只有1了。如何让它们的基因表达量相同，行使正常的生物学功能，哺乳动物采取的是让雌性动物中成对的染色体一条沉默，果蝇中采取相反的策略将雄性中的一条超量表达，这样做两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量的基因表达量，从而实现相近的遗传效应。那么ZW系统中的剂量补偿效应如何？带着这个问题研究团队研究了雌性（ZW）Z染色体上的763个基因在身体各个组织的表达量（除了性腺），他们发现雄性（ZZ）的这些基因的表达量（fpkm）要比雌性（ZW）2倍，这个数值是远小于2的，说明在半滑舌鳎的ZW染色体系统中剂量补偿效应是部分的。接着他们又进一步研究了雄性性（ZZ）中Z的表达量和常染色体的比：A:Z~=1；而雌性中这个数值是0.75（因为只有条Z，所有应该是0.5）；这个结果说明ZW在鱼中通过上调Z在雌性中的表达量来达到剂量平衡。这个结果与家蚕和鸟类中ZW性别决定系统的机制相同。
Figure 2 ZW染色体的组成及其相互关系；图上紫色的线表示重复序列的比例，蓝色的表示Z/W 染色体上的特异基因。黄色表示ZW染色体上具有同源关系的基因。灰色的代表ZW的基因和非性染色体上的基因具有同源性。橙色的区域表示在ZW染色体高度相似的区域，在减数分裂的时候可以发生同源重组。
Table 1 ZW染色体上的重复序列比例远高于常染色体。
Table 2 ZW 染色体上基因的统计。
鱼类ZW染色体的起源
既然已经有了多个鱼类和脊椎动物的染色体的序列，根据染色体上同源基因的共线性关系，就可以勾勒出从脊椎动物祖先，到半滑舌鳎的染色体变异过程，怎么融合，断裂，形成现在的染色体数目的。具体情况见Figure 5。研究者依据脊椎动物的祖先有11条染色体，经过了两次全基因组复制和一系列的染色体融合断裂时间，形成了今天的半滑舌鳎20+Z的染色体。结果表明半滑舌鳎的Z染色体和鸡的Z，15,17号染色体保持大块的同源区。研究者还比较了青鳉的X染色体和Z染色体体，发现机会没有共线性块，说明鱼类的X和Z是两套独立有的系统。而通过和人类的染色体比较，发现Z染色体和人9号，5号常染色体有同源关系。
Figure 3半滑舌鳎染色体进化示意图。
Figure 4半滑舌鳎Z染色体和X染色体的同源关系。
Z染色体性别决定机制
ZW系统中是否想XY系统中有个关键区域控制性别？或者是ZW中的区域一起控制性别？具体如何研究？
这个问题目前在鸟类中还没有搞清楚，但是半滑舌鳎有个特殊的现象：性逆转（详细情况见Figure 5）；在ZZ和ZW交配的个体，在常温（22℃）的情况下，大约有14%的ZW个体为性逆转个体（雄性）；在提高幼鱼的温度为28℃的时候，性逆转比例达到了73%，将这些假雄性（ZW）和雌性（ZW）进行交配，在常温下（22℃）生下的后代中基因型是ZW的个体中假雄性比例竟然达到了惊人的94%；假雄性的后代更容易假雄性，这不就是表观遗传吗？接着研究人员又对于F2代假雄性的个体的Z染色体的来源进行了分析，通过2个微卫星marker的鉴定，结果表明这些假雄性的个体中Z染色体均来源于F1的假雄性的，对于假雄性（F2）的后代的验证假雄性的Z来自于其父本。这也就说明雄性（ZZ）半滑舌鳎的性别决定模式是由Z染色体上相关基因的表观遗传决定。而雌雄（ZW）相关的决定机制还有待于深一步研究。
Figure 5 Z半滑舌鳎的性逆转和染色体如何控制性别决定和分化。a，b研究了假雄性的在F1和F2 代的比例。图C，统计了根据微卫星标记得到假雄性Z染色体的来源。结果表明这些Z染色体大部分来源于假雄性。
表观遗传最重要的是基因组DNA的甲基化现象，主要是什么基因的甲基化造成了Z决定雄性的呢？研究者做了一个简单的假设，这个假设是Z特异的基因的甲基化差异导致雄性。首先他们锁定了4个基因，这四个基因在文献于脊椎动物的性别分化有关，sf-1 , ptch1 和 fst 这三个基因表达于性别决定期间，存在于雄性，雌性和性逆转的雄性中，并且被甲基化。这不符合雄性决定的假设。dmrt1 引起了研究团队的关注，dmrt1基因在果蝇和线虫中被发现和雄性决定有关，那么在半滑舌鳎中是否也有相似的功能？研究团队仔细研究了这个基因的情况，如图Figure 6所示，
Ø Dmrt1 基因在Z染色体正常，W染色体高度退化成一个假基因。
Ø Dmrt1 高表达于雄性的生殖细胞和持续高表达与精巢中。
Ø 这个基因在精巢和卵巢中的甲基化模式是和它们的表达呈负相关的。
Ø 当然如果能做一个半滑舌鳎的遗传操作证明一下就更好了。可惜如目前其它海洋生物一样，还没有很好的转基因系统。
还有neurl3基因是Z特异的，以往研究证明有助于雄性精子生成，在半滑舌鳎中假雄性中没有W精子生成也支持这一假设。说明neurl3在半滑舌鳎中是有助于雄性分化的。
Figure 6 DMRT1 基因是雄性决定最主要的基因。A，通过原位荧光杂交（FISH）技术证实这个基因只存在于Z染色体上。B，DMRT1只高表达雄性发育的时期。C DMRT1的第一个外显子和内含子在卵巢中甲基化水平高。D通过分子探针杂交技术，显示DMRT1 基因高表达于精巢，而卵巢中则低表达。
读完这篇论文，深刻的感受的是生物大数据时代的来临，尤其是最近novaseq，bgi500和第三代测序技术的发展，一方面测序通量变得更高，成本更便宜，可以进行更大规模的转录组，基因组，及其宏基因组的研究。另一方面随着测序读长的持续增加和通量的提高，获得一个高质量的基因组已经十分可行。只要有好的研究材料，应用测序新技术，加上对于生物学问题的深入了解，进行个性化的数据分析，就能用数据说话，提供很多新的生物学发现或者验证很多已经提出的科学假设。尤其是对于多样性更丰富的非模式物种，就如半滑舌鳎的近期进化的ZW染色体系统；章鱼发达的神经；Nothobranchius furzeri 平均6个月短寿命；牦牛的高原适应；裸鼹鼠，盲鼹鼠的抗癌，长寿，耐低氧；蝴蝶美丽翅膀的拟态、、、
半滑舌鳎的研究开了个好头，生物学的研究也只是刚刚开了个头，二十一世纪是生物学的世纪，只是来的晚了一些。
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