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“分段消化”是分离心肌细胞的好方法 — 记令人难忘的一段回忆

已有 8062 次阅读 2011-3-31 07:05 |个人分类:科海浪花|系统分类:科研笔记| 实验方法, 心肌细胞分离, 分段消化

 在心血管研究中,人们常使用急性分离的心肌细胞做膜片钳或激光共聚焦实验,做上述实验时,需要细胞的数量不多,但要求细胞耐钙(不跳动)。如何在分离时每次都能得到耐钙的心肌细胞,已成为人们的关注热点。

 实际上,影响心肌细胞分离效果的因素很多,例如: (1)摘取心脏到主动脉插管迅速的时间,一般要求在2min 以内,时间过长可发生心肌缺血-再灌注损伤;(2)主动脉留存过短常导致插管穿过主动脉瓣而插入心室,过长会导致灌流液经主动脉分支流出,均可影响灌流效果;(3Lang endo ff 装置事先要排尽气泡,否则气栓可导致心肌损伤;(4)注意调节灌流液的酸碱度,偏酸偏碱均可造成心肌损伤等。

 通常采用Langendorff 离体灌流装置分离心肌细胞。首先用正常含钙液预灌注10-20min(冲残血,还氧债)无钙液灌注5min(解除心肌细胞间的桥粒和连接)→Ⅱ型或型胶原酶循环灌注(解离细胞间结缔组织)。由于称取酶量、生产公司和批号不同都会影响消化的时间和效果,所以各个研究小组报道胶原酶的消化时间也各不相同。一般当灌流液出现拉丝, 心脏膨大松软、颜色发白时停止胶原酶消化。

上述分离方法和注意事项可参见:

1)张紫冠, 李卫华, 黄峥嵘等。SD 大鼠心肌细胞分离方法探索。心血管康复医学杂志 2010 193):274-278

2)廖华,糜涛,涂志业等。成年大鼠心肌细胞分离方法的改良。中国组织工程研究与临床康复 第13 卷 第33 20091333):6536-6539    

(上述2篇论文可以从我的文献中“参考文献”类别中免费全文下载)

 

 传统的心肌细胞分离方法常采用固定的消化时间,结果常常是有时欢乐有时愁。香港大学的李贵荣教授提倡的分段消化法是分离心肌细胞屡试不爽的好方法。

 

 前几天,翻阅往日的照片时,无意中看见了我们和李贵荣教授的一些照片,它勾起了我们一段美好的回忆:

 1989-1990,我获得了世界卫生组织(WHO)的 奖学金,在全苏心脏病研究中心(莫斯科)学习膜片钳技术。杨宝峰院士相继在日本筑波Eisai研究所(1991-1992)和加拿大蒙特利尔心脏病研究所(1995-1996)读博士后。李玉荣教授也曾在全苏脑病研究所(1991-1992)做访问学者。为了在哈尔滨医科大学开展膜片钳研究,当时均为教研室副主任和副教授的我们三人,即杨宝峰(药理)、李玉荣(生理)徐长庆(病理生理),归国后自发组合成联合攻关小组。共同的理想,共同的信念,共同的战斗,使我们成为了休戚与共的好朋友,号称哈医大铁三角。

       联合攻关小组(杨宝峰,李玉荣,徐长庆)在研讨膜片钳实验

 

1997.6.20 – 23,为了推动膜片钳技术在全国的推广,哈医大举办了《膜片钳理论和实验学习班》。聘请当时加拿大蒙特利尔心脏研究所的李贵荣研究员为主讲人,杨宝峰教授、李玉荣教授和我作为副讲人,并向学员发放了由我们四人编写学习班讲义。

               

学习班全体合影

  会议结束时,我们还乘船游览了美丽的松花江,并在芦苇丛中合影留念。

 哈市江北合影(杨宝峰,李贵荣,李玉荣,徐长庆)

  在这次会议上,李贵荣教授向我们介绍了分离心肌细胞的分段消化法

 所谓的分段消化法和传统的心肌细胞分离方法没有本质的不同,只是同一个心脏实施胶原酶的消化时间不同。首先以灌流液拉丝,心脏松软、颜色发白确定一个平均消化时间(例如,30min)后,每次实施心肌细胞分离时,在这一时间点前后几个时间点(例如2025303540等)分别剪去少许心肌(一般由心底逐渐移至心尖),放入KB液中吹打,镜下观察。在这些时间点中,总会有1个或多个时间点的消化时间合适,确保每次都能获得满意的分离效果,可谓事半功倍”或“以一当十”

从这次学术会议后,我们成为了好朋友,多次互相访问。

访问香港大学时合影

海峡两岸心血管研讨会合影(昆明)

“分段消化”分离心肌细胞的方法在本课题组的实践中每每奏效,因此,我愿意将它奉献给开展心肌细胞分离的朋友,希望也能助大家一臂之力。



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